بخشی از مقاله
چکیده
در بین نشانگرهای ژنتیکی، توالی یابی ژنوم میتوکندری یکی از بهترین و رایجترین روشها برای طبقهبندی ژنتیکی جمعیتها و گونههای نزدیک به هم، بررسی امکان اشتقاق گونههای مختلف از یک جد مشترک، مطالعه رابطه فیلوژنی هر موجود با سایر گونهها و نژادها و دستیابی به راهکارهایی برای حفظ ذخایر ژنتیکی می باشد. هدف از این تحقیق تعیین توالی ناحیه ND5 ژنوم میتوکندری گاومیش خوزستان میباشد.
برای انجام این تحقیق تعداد 30 عدد نمونه خون از هر دو جنس از گاومیشهای غیر خویشاوند جمعآوری شد. پس از استخراج DNA از آنها، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهای اختصاصی با تکنیک PCR تکثیر و پس از خالصسازی توالییابی شدند. پس از تعیین توالی، با مقایسه توالی ناحیه ND5 ژنوم گاومیش خوزستان با توالی ناحیه مشابه از ژنوم گاومیشهای سایر نژادها از مناطق مختلف جهان، مشخص شد این نژاد با گاومیش-های بومی ایتالیایی و هندی در یک شاخه قرار دارد.
مقدمه
پرورش گاومیش از دیرباز در نقاط مختلف روستایی رایج بوده و پرورش دهندگان علاوه بر نیازهای خود، مازاد تولیدات را به فروش میرسانند و با ایجاد اشتغال، به اقتصاد خانوارهای روستایی و تولید بخشی از منابع غذایی کمک میکنند. علاوه بر این، گاومیشها به عنوان ذخایر مهم ژنتیکی به حساب میآیند که حفاظت از آنها برای نسلهای آینده نیز ضروری است. عمدتا در ایران 3 اکوتیپ مختلف گاومیش در شمال، شمالغرب و جنوبغرب کشور دیده میشود. اکوتیپ آذری با بیشترین جمعیت 70 - درصد کل گاومیشهای کشور - در شمال غرب و پس از آن اکوتیپهای خوزستانی 22 - درصد کل گاومیشهای کشور - و مازندرانی و گیلانی 8 - درصد کل گاومیشهای کشور - به ترتیب در جنوب غرب و شمال کشور وجود دارند.
منشاء گاومیشهای خوزستان به خوبی معلوم نیست ولی به نظر میرسد از گاومیشهایی هندوستان باشند که از گاومیش وحشی بوبالوس آرنی حاصل شدهاند. از لحاظ شکل ظاهری نیز گاومیشهای جنوبی و گاومیشهای هندوستان شبیه یکدیگر هستند و احتمالا تفاوتهای جزئی بین آنها به دلیل تفاوتهای محیطی است که در طول زمان با آنها تطابق حاصل کردهاند.
این گاومیشها عمدتاً برای تولید شیر نگهداری میشوند و در شرایط بهینه تغذیه و مدیریت، دارای خصوصیات تولیدی مناسب هستند و میتوانند روزانه به طور متوسط 8 تا 12 لیتر شیر تولید نمایند. متوسط درصد چربی شیر گاومیشهای اکوتیپ خوزستانی 7 تا 9 درصد است. در جنوب غرب کشور، در روستاهای اطراف خرمشهر، آبادان و شادگان، روستاییان به پرورش و نگهداری گاومیش اشتغال دارند. در این نواحی بیشتر گاومیشها به صورت گلههای بزرگ و کوچک نگهداری میشوند که تعداد گاومیشهای موجود در هر گله بین ده رأس و گاهی بیش از پنجاه رأس است. در این منطقه گاومیش عمدتاً به منظور استفاده از شیر و گوشت نگهداری میشود
یکی از راههای شناسایی نژادهای مختلف گاومیش استفاده از ژنوم میتوکندری است. میتوکندری اندامکی سیتوپلاسمی است که در بیشتر سلولهای بدن وجود دارند. این اندامک که قادر به تولید انرژی برای سلول است؛ دارای DNA حلقوی اختصاصی و مستقل از DNA هستهای است و در گونههای جانوری 37 ژن را کد میکند که شامل 13 ژن کدکننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و 2 ژن کد کننده rRNA است و طول تقریبی آن 16 کیلو جفت باز میباشد
از کاربردهای ژنوم میتوکندری میتوان به تشخیص همزمان گوشت گونههای مختلف مثل گاو، گاو میش، گوسفند و بز در مخلوط گوشت [1]، تشخیص هویت .[5]، تشخیص تنوع ژنتیکی و تعیین رابطه فیلوژنتیکی بین جمعیتها و گونههای نزدیک به هم [3] اشاره کرد. با توجه به موارد گفته شده شناسایی توالی ژنوم میتوکندریایی به عنوان مشخصه ژنتیکی ثابت محسوب شده و میتواند به تهیه شناسنامه ژنتیکی و نگهداری خلوص نژادهای بومی کمک فراوانی نماید. در ضمن با مقایسه توالی یک گونه یا نژاد با گونهها و نژادهای دیگر که توالی آنها در بانک ژن موجود است امکان انجام مطالعات فیلوژنتیکی، بررسی اشتقاق گونهها و محاسبه فاصله نسلی وجود دارد. بنابراین تحقیق حاضر با هدف مطالعه توالییابی و بررسی بیوانفورماتیکی ناحیه ND5 گاومیشهای استان خوزستان انجام شد.
مواد و روشها
در این تحقیق نمونهگیری از 30 رأس گاومیش موجود در ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گاومیش صفی آباد خوزستان و چندین گله مردمی تحت پوشش امور دام استان خوزستان صورت گرفت. نمونههای خون به مقدار 5 میلیلیتر از سیاهرگ وداج گردنی، در تیوبهای حاوی ماده ضد انعقاد EDTA اخذ و تا زمان استخراج DNA در فریزر -20oc نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از روش اصلاح شده نمکی انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده به روش طیف سنجی با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر Thermo - Nano Drop-ND 2000، آمریکا - سنجیده شد. طراحی آغازگر برای تکثیر بخشی از توالی ژن ND5 از mtDNA با استفاده از نرم افزار Premier Biosoft, - Primer premier 5 - USA و ژنوم کامل میتوکندری گاومیش صورت گرفت.
با استفاده از رویه BLAST موجود در پایگاه بانک جهانی ژن، میزان همپوشانی آنها با توالیهای موجود، مقایسه گردید. واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تکثیر قطعه 993 جفت بازی ناحیه ژنی ND5 از mtDNA توسط دستگاه ترموسایکلر Biometra مدل T-personal براساس روش استاندارد انجام گرفت. پس از آزمایش غلظتهای مختلف اجزا PCR، شرایط بهینه PCR با حجم نهایی 15 O به صورت 1x بافر PCR، Mgcl2 2 mM، 0/25 0 آغازگر، 200 0 dNTPs، یک واحد آنزیم Taq پلیمراز و DNA الگو به میزان 150 ng بدست آمد. برنامه حرارتی مناسب برای آغازگر مورد مطالعه به صورت: واسرشته سازی اولیه در 95 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه و 35 سیکل شامل:
واسرشته سازی ثانویه در 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و مرحله بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه انتخاب و بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه در نظر گرفته شد. الکتروفورز محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز بر روی ژل آگارز 1 درصد و رنگآمیزی ژل با اتیدیوم بروماید صورت گرفت.
مقدار 100 میکرولیتر از محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز، خالصسازی و به همراه 50 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت و برگشت، با غلظت 10 پیکومول به منظور تعیین توالی به شرکت MacroGen کره جنوبی ارسال گردید. این نمونهها با استفاده از دستگاه ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر توالییابی شدند. سپس با استفاده از ابزار BLAST و رویه blastn در پایگاه NCBI میزان همولوژی توالیهای بدست آمده سنجیده شد. به منظور بررسی رابطه فیلوژنتیکی نژادهای مورد مطالعه، نمودار درختی با استفاده از رویه UPGMA توالیهای همردیف شده، به کمک نرم افزار [4] Bioedit ترسیم گردید. همچنین برای تعیین هاپلوتیپها از رویه Disparity Index Analysis نرم افزار [8] MEGA6 استفاده شد.
نتایج و بحث
استخراج DNA از تمام نمونهها با موفقیت انجام گرفت. نتایج طیف سنجی نشان داد که ِDNA استخراج شده از کیفیت مناسبی برخوردار است. الکتروفورز محصولات تکثیر شده بر روی آگارز 1 درصد نشان داد که آغازگرهای طراحی شده به خوبی فعالیت نموده و قطعه اختصاصی برای ND5 به طول 993 جفت باز تکثیر نمودند. با استفاده از نرم افزار Chromas Lite توالیهای خوانش شده با فرمت ABI به صوت منحنی و قلههای رنگی قابل مشاهده بودند
سپس با تغییر میزان کشیدگی قلههای رنگی صحت خوانش نوکلئوتیدها در تمام توالیها بررسی شد. بررسیها نشان داد قسمت ابتدای توالی به خوبی مورد خوانش قرار نگرفته بود که محل اتصال پرایمر است. توالییابی در سایر نقاط با کیفیت بسیار مناسبی صورت گرفته بود. به طور کلی کیفیت توالییابی مناسب بود که ناشی از خالصسازی قطعات تکثیری قبل از ارسال نمونهها میباشد.
شکل -1 بررسی صحت توالییابی نمونه ها
