بخشی از مقاله
چکیده
ایران با داشتن 27 نژاد گوسفند اهلی به همراه 5 زیر گونه گوسفند وحشی، داراي ذخیره ژنتیکی با تنوع کم نظیري در دنیا می باشد. هدف از انجام این پژوهش توالی یابی ناحیه D-loop ژنوم میتوکندري در سه نژاد گوسفند ایرانی - لري، لري بختیاري و عربی - به منظور بررسی تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی بین نژادهاي مذکور و همچنین بررسی ارتباط مادري این نژادها با سایر نژادهاي جهانی بود. بدین منظور، 30 نمونه خون - از هر نژاد 10 نمونه - از نقاط مختلف استان خوزستان جمع آوري و پس از استخراج DNA، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهاي اختصاصی با استفاده از روش PCR تکثیر گردید. محصولات PCR توالی یابی و سپس آنالیز نتایج با استفاده از نرم افزارهاي بیوانفورماتیکی انجام گرفت. با تجزیه و تحلیل داده هاي حاصل از تعیین توالی و مقایسه توالی HVR1 این سه نژاد با یکدیگر و با توالی سایر نژادهاي جهانی، مشخص شد که در بین نژادهاي مورد مطالعه نژاد گوسفند لري و عربی متعلق به گروه هاپلوتایپی B و نژاد لري بختیاري متعلق به گروه هاپلوتایپی A می باشد. که این امر در مورد نژاد عربی و لري ممکن است به دلیل نزدیکی جغرافیایی مکان زیستی آنها باشد.
واژگان کلیدي: ژنوم میتوکندري، تنوع ژنتیکی، درخت فیلوژنتیک، D-loop، .HVR1
مقدمه
اهلی کردن گوسفند حدود 11000 -10000 سال پیش در منطقه گستردهاي از کوه هاي زاگرس شمالی ایران تا جنوب شرقی آناتولی ترکیه رخ داده است. گوسفند به لحاظ اقتصادي یکی از حیوانات اهلی مهم در ایران و همچنین در سایر نقاط جهان است - . - 2 سهم گوسفند در ایران را می توان به عنوان منبع گوشت، پشم، پوست و شیر در نظر گرفت. خصوصیات ژنتیکی نژادهاي مختلف گوسفند، اولین گام براي جمع آوري اطلاعات پایه - مبنا - براي بهبود راند مان تولید در این صنعت است. ديانآي میتوکندریایی پتانسیل خوبی براي مطالعه ژنتیک جمعیت و تکامل نشان داده است. میتوکندري تنها اندامک درون سلولی داراي ديانآ است، نرخ جهش بالا و سیر تکاملی آن 5 تا 10 برابر سریعتر از ديانآ سلولی است - . - 5
در گونههاي جانوري ژنوم میتوکندریایی 37ژن را کد میکند که شامل 13 ژن کد کننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و 2 ژن کد کننده rRNA میباشد. کد کردن tRNA و rRNA نشاندهنده سنتز پروتئین در میتوکندري است . - 8 - ژنوم میتوکندري حاوي ناحیه بسیار متغیر بنام Displacement- loop یا D-loop است که پروتئینی کد نمی کند و با فرکانس بسیار زیادي حدود 10 برابر ديانآ هسته اي تمایل به جهش دارد. چون این ناحیه ژن رمز کننده پروتئین ندارد در نتیجه جهش می تواند در آنجا تجمع یابد. این ناحیه همانند سازي ديانآ میتوکندري را به وسیله تنظیم فعالیت پروتئین ها و آنزیم هاي مختلف که به وسیله ژنهاي هسته کد می شوند، کنترل می کند توالی ناحیه کنترل در گونه هاي مختلف حیوانات بسیار متفاوت است و داراي دو ناحیه بسیار متغیر HVR1 و HVR2 است.
ژنوم میتوکندري براي دو دهه است که به عنوان مارکر مولکولی در ژنتیک جمعیت استفاده می شود. امروزه با کشف توالی هاي موجود در میتوکندري امکان بررسی ژنهاي کنترل کننده موجود در این اندامک به عنوان یکی از دیدگاه هاي جدید و مهم مطالعات ژنتیکی در آمده است . - 4 - منشأ سیتوپلاسم سلول تخم متعلق به گامت ماده بوده و در هنگام لقاح، سیتوپلاسم گامت نر خارج از اووسیت باقی می ماند و قادر به ورود به داخل غشاي تخمک نیست بنابراین تمامی سیتوپلاسم سلول تخم به سیتوپلاسم تخمک تعلق دارد. به همین دلیل و بدلیل اینکه دورگه شدن ديانآ میتوکندري با ديانآ هسته سلول وجود ندارد، باعث میگردد که در بررسی هاي فیلوژنی و بررسی انشقاق گونه ها، تفاوتهاي موجود در توالی ديانآ میتوکندري هر موجود می توان رابطه فیلوژنی آن را با گونه ها و نژاد هاي خارج از دسترس که توسط دیگر محققین و حتی در سالهاي متفاوت مطالعه شده است مقایسه نموده و اطلاعات ارزشمندي به دست آورد . - 5 - هدف از انجام این پژوهش توالی یابی ناحیه D-loop ژنوم میتوکندري در سه نژاد گوسفند ایرانی - لري، لري بختیاري و عربی - به منظور بررسی تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی بین نژادهاي مذکور و همچنین بررسی ارتباط مادري این نژادها با سایر نژادهاي جهانی می باشد.
مواد و روش
براي انجام این پژوهش، مقدار 30 نمونه خون از ورید وداج گوسفندان نژادهاي لري، عربی و لري بختیاري، از نقاط مختلف استان خوزستان تهیه شد. استخراج DNA به وسیله کیت شرکت سیناکلون صورت گرفت و پس ازاستخراج، به منظور بررسی کیفیت و کمیت DNAهاي استخراج شده، از روش الکتروفورز ژل آگارز 1درصد و طیف سنجی با دستگاه نانو دراپ مدل استفاده شد. پرایمر مورد نظر با استفاده از برنامه vector NTI 11 طراحی شد. ویژگی آغازگر مورد استفاده در جدول شماره 1 آمده است. واکنش زنجیره اي پلیمراز در 35 چرخه و با حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام گرفت. به منظور تایید تکثیر ناحیه مورد نظر، طی واکنش PCR، الکتروفورز محصولات PCR برروي ژل آگارز 2 درصد صورت گرفت. در نهایت نمونه ها پس از تلخیص براي توالی یابی به شرکت تکاپوزیست ارسال شدند.
تعیین توالی قطعات مورد مطالعه براي تمامی نمونه ها انجام گرفت و نتایج حاصل از توالی هاي مربوط به نمونه ها از لحاظ کیفیت توالی یابی براي هر نوکلئوتید، توسط نرم افزار بیو ادیت مورد ارزیابی قرار گرفتند و نتایج نشان داد که خوانش ها براي تمامی نمونه ها با کیفیت بالایی صورت گرفته است. در ادامه با استفاده از ابزار BLAST درصد تشابه توالی ناحیه مورد مطالعه در سه نژاد مذکور با توالی هاي ثبت شده در پایگاه NCBI تعیین شد، که این نتایج بر این دلالت دارد که این ناحیه حفاظت شده بوده و تغییرات نکلئوتیدي در آن به ندرت رخ می دهد. به منظور مشخص ترشدن جایگاه دقیق سه نژاد گوسفند - لري، عربی و لري بختیاري - در بین 5 هاپلوتیپ شناسایی شده، درخت فیلوژنتیکی به روش NJ و با استفاده از نرم افزار MEGA5 ترسیم شد - شکل3 و. - 4
نتایج و بحث
استخراج DNA از تمام نمونه ها با موفقیت صورت گرفت. درخشندگی و وضوح باندها به علت غلظت زیاد DNA در محلول استخراج شده می باشد - شکل. - 1همانطورکه اشاره شد، در گوسفندان اهلی تاکنون 5 گروه هاپلوتایپی A،B،C،D وE تشخیص داده شده است. با توجه به نتایج درخت فیلوژنتیک و تعیین هاپلوتیپها با روش NJ ، نژاد گوسفند عربی و لري در دسته گروه گوسفندان ترکیه و نژاد لري بختیاري در دسته گروه گوسفندان چینی قرار گرفت - شکل . - 3 نژاد گوسفند عربی و لري در گروه هاپلوتیپ B و نژاد لري بختیاري جز گروه هاپلوتیپ A قرارگرفته اند - شکل . - 4 قرارداشتن گوسفند نژاد مغانی و گوسفند نژاد بلوچی - 3 - و گوسفندان نژاد مغانی، لري بختیاري، سنگسري، بلوچی، کرمانی، شال، قره گل و کردي - 6 - در گروه هاپلوتیپی A ، گواه تعلق گوسفندان ایرانی به این گروه
