بخشی از مقاله
چکیده
تنش شوری یکی از مهمترین تنشهای محیطی است که همه ساله کشت گیاهان زراعی را در مناطق وسیعی از کشور تحت تأثیر قرار میدهد. به منظور بررسی پروتئینهای دخیل در پاسخ به تنش شوری برگ اکوتیپ یونجه بمیبر مبنای الگوی الکتروفورز دو بٌعدی، آزمایشی با دو تیمار - صفر و 200 میلی مولار کلرید سدیم - و شش تکرار - در قالب نقشه آزمایشی طرح بلوکهای کامل تصادفی - تحت سیستم کشت هیدروپونیک در گلخانه دانشگاه تبریز اجرا شد. به منظور استخراج پروتئین بافت برگ از روش acetone استفاده شد. جهت تفکیک پروتئینها از Isoelectric focusingبرای بٌعد اول و از روش SDS- PAGEبرای بٌعد دوم استفاده شد. ژلها با آبی کوماسی رنگ آمیزی شدند و پس از رنگ بری اسکن شده و توسط نرم افزار PD-Quest مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج نشان داد که 14 لکه تکرار پذیر تحت تنش شوری تغییر بیان داشتند طوریکه، پنج لکه پروتئینی کاهش بیان و 9 لکه پروتئینی افزایش بیان نشان دادند. شناسایی احتمالی پروتئینها با توجه به دو مشخصه نقطه ایزوالکتریک و وزن ملکولی تقریبی انجام شد. پروتئینهای شناسایی شده جزء پروتئینهای دخیل در سیستم دفاعی - پروتئین های درگیر در بیوسنتز لیگینین و پروتئین های درگیر در دفاع میکروبی و کلروپلاستی - ، تنظیم کننده - تنظیم ساکارز ، تنظیم بیان ژن - ، مسیرهای متابولیسم انرژی، پروتئینهای تثبیت کننده نیتروژن و کانالی بودند. همه پروتئینهای تنظیم کننده دارای افزایش بیان بوده و بیشترین میزان افزایش بیان نیز در این گروه مشاهده شد. دو پروتئین درگیر در متابولیسم انرژی، Uracil phosphoribosyl transferase lastic و -hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase 1، افزایش بیان داشتند، که شاید در جهت حفظ رشد یونجه تحت تنش شوری باشد.
کلمات کلیدی: الکتروفورز دوبعدی، پروتئینهای دفاعی، تنش غیر زیستی
.1 مقدمه
یونجه زراعی - Medicago sativa L. - بیش از 32 میلیون هکتار از زمینهای زراعی دنیا را به خود اختصاص داده است [9] و مهمترین گیاه علوفهای برای تغذیه دام است که پس از غلات، مهمترین محصول اقتصادی در دنیا نیز محسوب میشود. از طرف دیگر همزیستی یونجه با باکترهای ریزوبیوم و در نتیجه تثبیت نیتروژن مولکولی ، اهمیت آن را برای تناوب با محصولات زراعی دیگر برای حاصلخیزی خاک زیادتر کرده است، بنابراین در کشاورزی پایدار نیز نقش اساسی دارد .[22] ازعوامل غیرزیستی محدودکنندهی عملکرد گیاهان زراعی در بیشتر مناطق کشاورزی دنیا و ایران، شوری آب و خاک می-باشد. تنش شوری، تولیدات گیاهی و کیفیت آن را در نواحی خشک، نیمه خشک و مناطقی با بارش باران محدود، تحت تاثیر قرار میدهد .[2] گیاهان از نظر مقاومت یا حساسیت به شوری متفاوت میباشند. این تفاوتها در جنسها و گونههای متفاوت و حتی میان اکوتیپهای یک گونه وجود دارد. افزایش مقاومت گیاهان به شوری و انتخاب گونههای مناسب برای کاشت در مناطق شور، اهمیت زیادی از نظر کشاورزی و اقتصادی دارد .[22] در بین گیاهان زراعی و علوفهای، یونجه جزو گیاهان متحمل به شوری شناخته میشود، که حساسترین مرحله فنولوژیکی آن نسبت به شوری، مرحله گیاهچهای و استقرار گیاه است. گیاهان در محیط شور با دو عامل اصلی شامل کاهش پتانسیل اسمزی خاک و ایجاد سمیت یونی مواجه هستند.
نمک زیاد در محلول خاک پتانسیل اسمزی خاک را پایین آورده و باعث کاهش جذب و کمبود آب در گیاه میشود. این امر موجب اختلال در تقسیم سلول و بزرگ شدن سلولها شده و تمام واکنشهای متابولیکی گیاه را تحت تاثیر قرار می-دهد. مقادیر بالای یونهای سدیم و کلر موجب کاهش جذب یونهای عناصر ضروری از جمله پتاسیم، کلسیم، آمونیوم و نیترات شده، و نیز از فعالیت آنزیمها کاسته و ساختار غشاء را بر هم میزند. این اثرات سبب کاهش فعالیتهای متابولیکی گیاه از جمله فتوسنتز شده و از رشد گیاهان در محیطهای شور میکاهد .[11] واکنش گیاهان در مقابل تنش شوری از طریق تغییر در صفات مورفولوژیکی، تغییر غلظت سدیم و پتاسیم، همچنین فعال شدن مجموعهای از ژنها و کد کردن پروتئین-های مختلف تظاهر پیدا میکند .[2] تنش شوری منجر به تغییر الگوی پروتئوم بافتهای گیاهی شده و با توجه به اینکه پروتئینها محل پاسخ گیاه به تنش میباشند، رهیافت پروتئومیک در مطالعه این پاسخ به عنوان یک ابزار قوی مد نظر قرار میگیرد. با پروتئومیک تعداد زیادی از پروتئینها در بافتهای مختلف قابل بررسی بوده و تغییرات پروتئین در شرایط مختلف قابل مطالعه میباشد .[15] در این راستا تاثیر تنش کلرید سدیم برروی پروتئین های پاسخ دهنده در اکوتیپ یونجه بمی بعنوان یک اکوتیپ متحمل مورد بررسی قرار میگیرد.
.2 مواد و روشها
مواد گیاهی: بذور مورد استفاده در این پژوهش، اکوتیپ یونجه بمی مقاوم به شوری [1 ] است که از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان شرقی تهیه شد. نحوه اعمال تنش شوری: یک هفته بعد از جوانهزنی، گیاهچههای یک دست به گلدانهای حاوی پرلیت انتقال داده شد. گیاهچهها در شرایط دمای 26±2 درجه سانتیگراد و طول روز 16 ساعت نوری قرار داده شد. وقتی گیاهچههای یونجه در داخل گلدانها تحت شرایط گلخانهای به مرحله هفت برگی رسیدند تنش شوری 200 میلیمولار کلرید سدیم به صورت تدریجی به مدت 15 روز اعمال گردید. این آزمایش در سال 1396 در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز با دو تیمار - صفرو 200 میلی مولار کلرید سدیم - در شش تکرار - در قالب نقشه آزمایشی طرح بلوکهای کامل تصادفی - اجرا شد.
الکتروفورز دوبعدی: استخراج پروتئین با روش TCA/acetone تغییر یافته انجام گرفت .[8] برای انجام الکتروفورز بعد اول از ژلهای لولهای دست ساز استفاده گردید که حاوی آب دیونیزه، 10 NP-40 درصد، محلول آکریلآمید 30 درصد، آمفولینهای با 3/5 pH تا 10 و 5 تا 7، آمونیوم پرسولفات 10 درصد و محلول TEMED میباشد. محلول پروتئینی بر حسب غلظت پروتئینهای بافت برگی بر روی ژل بعد اول بارگذاری شد. برای جداسازی پروتئینها بر اساس نقطه ایزوالکتریک آنها، ابتدا به مدت 30 دقیقه ولتاژ 200 ولت، به مدت 16 ساعت ولتاژ 400 ولت و به مدت یک ساعت ولتاژ 600 ولت اعمال گردید. برای جداسازی پروتئینها بر اساس وزن مولکولی آنها از روش SDS-PAGE استفاده گردید. رنگآمیزی ژلها با آبی کوماسی G250 انجام گرفت و سپس مرحله رنگ بری ژلها به مدت 16 ساعت صورت پذیرفت. برای تصویربرداری از ژلها دستگاه Bio- Rad GS -800 مورد استفاده قرار گرفت. تصاویر به دست آمده توسط نرمافزار PD-Quest مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و ژلها به همراه تکرار آنها بررسی شده و لکههای مشترک بین تکرارها توسط نرمافزار برچسب زده شدند.
.3 نتایج وبحث
در این پژوهش تغییرات بیان پروتئینهای بافت برگ اکوتیپ یونجه بمی تحت تنش شوری 200 میلیمولار کلرید سدیم با رهیافت پروتئومیک جهت شناسایی پروتئینهای پاسخ دهنده مورد مطالعه قرار گرفت. برای شناسایی لکههای پروتئینی معنیدار و به منظور تعیین نوع تغییرات بیان پروتئین - افزایش یا کاهش بیان - به ترتیب از آزمون تی و شاخص القا - IF - 1 استفاده شد. در این مطالعه لکههایی با IF بزرگتر از 2، افزایش بیان و لکههایی با IF کمتر از 0/5، به عنوان کاهش بیان در نظر گرفته شدند. پس از تجزیه تصاویر ژلها، 14 لکه پروتئینی تکرارپذیر و معنیدار شناسایی شد. که از بین این پروتئین-های تغییر بیان یافته، پنج لکه کاهش بیان و 9 لکه افزایش بیان نسبت به شاهد از خود نشان دادند. بعد از شناسایی احتمالی پروتئینها - با توجه به دو مشخصه نقطه ایزوالکتریک و وزن ملکولی - ، گروههای عملکردی شامل پروتئینهای درگیر در سیستم دفاعی 36 - درصد - ، پروتئینهای تنظیم کننده 29 - درصد - ، پروتئینهای درگیر در متابولیسم انرژی 21 - درصد - ، پروتئین تثبیت کننده نیتروژن - هفت درصد - و پروتئینکانالی - هفت درصد - بودند - جدول . - 1
پروتئینهای دخیل در سیستم دفاعی: لکه شماره 2305 مربوط به پروتئین Probable cinnamyl alcohol dehydrogenase که تحت تنش شوری کاهش بیان داشت. آخرین آنزیم درگیر در بیوسنتز لیگنین است .[4] یکی از مکانیسمهای حفاظتی غیرآنزیمی تحریک شده تحت تنشهای غیرزیستی از جمله تنش شوری، بیوسنتز ترکیبات فنلی است. آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز آغازگر مسیر فنیل پروپانوئید میباشد که -Lفنیل آلانین را با دآمیناسیون به ترانسسینامیک اسید تبدیل میکند. این مسیر، مسیر اصلی بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در سلول میباشد. بابک خانی و همکاران [3] با بررسی تاثیر تنش اسمزی در یونجه عنوان کردند که تنش اسمزی باعث تولید بیشتر میزان ترکیبات فنلی درگیر در مسیر بیوسنتز لیگنین میشود. لکه شماره 4501 مربوط به پروتئین Receptor-like protein 42 که تحت تنش شوری کاهش بیان داشت و جزء پروتئینهای درگیر در دفاع میکروبی میباشد. شناساییMAMPs واکنشهای دفاعی را از طریق عناصر میانی مانند نشر یونی در طول غشای پلاسمایی، بیوسنتز اتیلن و تحریک پروتئینهای کینازی فعال شونده توسط میتوژن، فعال میکنند. افزایش بیان ژن گیرنده شبه کینازی موجب تاثیر در ترارسانی پیامهای تنش در گیاهان شده و سبب القای ژنهای درگیر در تنش میگردد. لکه پروتئینی شماره LIM domain-containing - 5102 - protein PLIM2a، به رشته های اکتین میپیوندد و باعث ضخیم شدن رشته میشود.
افزایش بیان این پروتئین در آفتابگردان تحت تنش شوری در جهت حفظ رشددانه گرده و رشد گیاه توسط [21] گزارش شده است. در این آزمایش این لکه پروتئینی در شرایط تنش افزایش بیان داشت. لکه پروتئینی شماره Glutamyl-tRNA reductase 2, - 9402 - chloroplastic، پروتئین کلروپلاستی بوده و نقش مهمی در کاهش خطرات ناشی از حمله گونههای فعال اکسیژن دارد. گیاهان جهش یافته نسبت به این پروتئین در نمو کلروپلاست، کارآئی دستگاه فتوسنتزی، محتوای رنگیزهها از جمله کلروفیل، کارتنوئیدها و گزانتوفیلها، عملکرد دانه، احیا پروکسیردوکسین و محافظت در مقابل تنش اکسیداتیو کاهش نشان داده است [17] .پروتئین UDP-glycosyltransferase 73B4 - لکه - 8401 که نقش بسیار مهمی در سمزدایی - از طریق 2'4'6-trinitrotoluene حاصل از مسیر -cگلوکوز - دارد و جزء پروتئینهای با عملکرد دفاعی محسوب میشود [10]، در این آزمایش این لکه پروتئینی در شرایط تنش افزایش بیان داشت.
