بخشی از مقاله
چکیده
پروتئین هاي دیواره از طریق مدیریت معماري و ساختار دیواره، متابولیسم، بزرگ شدن وفرآیند هاي سیگنالینگ، نقش مهمی در پاسخ به استرس هاي زنده و غیر زنده ایفا می کنند. در دیواره و فضاي آپوپلاستی گیاهان هالوفیت که طی تکامل نسبت به شوري مقاومت دارند، وضعیتی برخلاف شرایط سازمان یافته فضاي سیتوپلاسمی وجود دارد و دیواره سلولی مستقیماً در معرض فشار اسمزي یونی ناشی از تنش شوري قرار می گیرد، پس می توان گفت که گیا هان هالوفیت فشار تکاملی متمایزي را روي مولکول هاي عملکردي آپوپلاستی و سیتوپلاسمی تحمل کرده اند.
از آنجایی که می توان گفت بخشی از مکانیسم تحمل به شوري هالوفیت ها در سازوکار پروتئینی دیواره سلولی شان نهفته است، تعیین نقشه پروتئینی دیواره سلولی آلوروپوس می تواند کمک بزرگی براي مطالعه در این زمینه باشد .غرق بودن پروتئین هاي دیواره اي در یک ماتریکس پلی ساکاریدي نامحلول و اثرات متقابلی که با دیگر اجزاء دیواره سلولی دارند،استخراج آن ها را با چالش هاي جدي مواجه می کند.
در مطالعه حاضر، پروتکل جداسازي دیواره سلول و استخراج پروتئین براي ارزیابی پروتئوم دیواره سلولی گیاه آلوروپوس لیتورالیس مورد بهینه سازي قرار گرفت. اطلاعات بدست آمده نشان داد روش استخراج پروتئین بر پایه اوره، بالاترین کارایی را جهت استخراج بیشترین تعداد لکه هاي پروتئینی دارد. نحوه قرار گیري و پراکنش پروتئین ها بر روي ژلهاي دو بعدي در همه روشهاي استخراج مشابه بود.
مقدمه
دیواره سلولی یک تشکیلات دینامیک جهت تقابل با فاکتور هاي محیطی است و تنوعات ساختاري و کارکردي دیواره سلولی بازتابی از طبیعت پروتئین هاي دیواره اي می باشد.
پروتئین هاي دیواره از طریق مدیریت معماري و ساختار دیواره، متابولیسم، بزرگ شدن وفرآیند هاي سیگنالینگ، نقش مهمی در پاسخ به استرس هاي زنده و غیر زنده ایفا می کنند - . - Zhu, 2005 دیواره سلولی گیاهان یک فضاي تکاملی خاص را براي امکان سازگاري پروتئین هاي خارج سلولی وابسته به محیط ایجاد می کند .در دیواره و فضاي آپوپلاستی گیاهان هالوفیت که طی تکامل نسبت به شوري مقاومت دارند، وضعیتی برخلافشرایط سازمان یافته فضاي سیتوپلاسمی وجود دارد و دیواره سلولی مستقیماً در معرض فشار اسمزي یونی ناشی از تنش شوري قرار می گیرد، پس می توان گفت که گیا هان هالوفیت فشار تکاملی متمایزي را روي مولکول هاي عملکردي آپوپلاستی و سیتوپلاسمی تحمل کرده اند.
طی یک سازگاري منحصر به فرد در پروسه هاي تکاملی، هالوباکتریا جهت دستیابی به حداکثر فعالیت آنزیم ها و عملکرد مناسب ماشین متابولیکی شان تحت غلظت هاي بالاي یون تخصصی شده اند به گونه اي که براي داشتن حداکثر فعالیت آنزیمی نیاز اکید به غلظت هاي بالاي یون دارند، این در حالی است که تا کنون هیچ گیاه یوکاریوت هالوفیتی یافت نشده است که مثل هالوباکتریا عمل کند و در واقع نیاز به ایجاد سازگاري در آنزیم هاي سیتوپلاسمی هالوفیت ها از طریق تسهیم مرتفع می شود
ما با دانش کنونی می دانیم که یکی از اصول مکتب هالوفیتیسم اجتناب از تماس ماشین متابولیکی درون سیتوپلاسم گیاه با سطوح بالاي یون سدیم می باشد، اما آنزیم هاي دیواره اي ملزم به فعالیت در حضور غلظت هایی از یون سدیم می باشند و آنالیز پروتئوم دیواره سلولی امکان شناسایی سازوکارهاي درگیر در تحمل به شوري را فراهم می کند آلوروپوس لیتورالیس به عنوان یک هالوفیت علفی چند ساله دیپلوئید - 2n=2x=14 - با فتوسنتز از نوع متابولیسم C4، داراي ویژگی هاي منحصر به فردي از قبیل اندازه کوچک ژنوم، غناي ژنتیکی از نظر دستیابی به ژن ها و پروموتر هاي درگیر در سازگاري به شوري و خشکی و نیز تکثیر رویشی و زایشی آسان، می باشد که این فاکتورها گیاه را به عنوان کاندیداي مدل ژنتیکی براي بررسی و مطالعه مکانیسم هاي تحمل به شوري، خشکی و گرما در گیاهان تک لپه مطرح کرده اند
از آنجایی که می توان گفت بخشی از مکانیسم تحمل به شوري هالوفیت ها در سازوکار پروتئینی دیواره سلولی شان نهفته است، تعیین نقشه پروتئینی دیواره سلولی آلوروپوس می تواند کمک بزرگی براي مطالعه در این زمینه باشد . غرق بودن پروتئین هاي دیواره اي در یک ماتریکس پلی ساکاریدي نامحلول و اثرات متقابلی که با دیگر اجزاء دیواره سلولی دارند،استخراج آن ها را با چالش هاي جدي مواجه می کند. در مطالعه حاضر، پروتکل جداسازي دیواره سلول و استخراج پروتئین براي ارزیابی پروتئوم دیواره سلولی گیاه آلوروپوس لیتورالیس مورد بهینه سازي قرار گرفت.
موادو روش ها
آماده سازي نمونه:
ابتدا گلدان هایی به طول 30 و عرض و ارتفاع 10 سانتی متر تهیه و کف گلدان ها در امتداد طولی، شیار باریکی تعبیه شد، پس از قرار دادن یک صفحه توري باریک روي شیار مذکور، درون گلدان ها با ماسه شسته شده پر شد. سپس گلدان ها را درون باکس پر از آب قرار دادیم تا از طریق مویینگی ماسه ها رطوبت جذب کنند. بذر ها درون شیاري که در وسط ماسه ها به عمق نیم سانتیمتر ایجاد کردیم کشت شدند، بعد از حدود یک هفته از شروع کشت، گلدان ها به محیط کشت هوگلند منتقل شد. لازم است محیط ها هر هفته با محیط تازه تعویض و PH محیط هاي کشت هر روز تنظیم شوند. پس از حدود 40 روز که حجم مناسبی از گیاه آلوروپوس به دست آمد نمونه ها برداشت شده و در فریزر-80 نگهداري شدند.
استخراج دیواره سلولی:
براي استخراج دیواره از شاخساره، 20 گرم ماده گیاهی به همراه - - Polyvinylpolypyrrolidone - pvpp15% - w/w و100ml بافر شامل - - 0.7M Sucrose, 0.5MTris-HCL PH=8, 10mM EDTA, 4mM ascorbic acid, 0.4% - v/v - β-mercaptoethanol توسط مخلوط کن کاملا همگن شدند، سپس این مخلوط همگن از فیلترهایی با شماره 50 و 100عبور داده شده و آنچه که از فیلتر 100 رد می شد توسط سانتریفیوژ رسوب داده شد . پلت حاصل که همان دیواره سلولی است به منظور حذف یون هاي فلزي و برخی ناخالصی ها، 3 بار با محلول 6% - w/v - pvp 40/methanol شستشو داده شده و در نهایت 3 شستشوي دیگر با محلول استون/متانول%10 با هدف حذف موادآلی کوچک از قبیل - قند ها، فنل ها،چربی ها و... - صورت گرفت.
استخراج پروتئین هاي دیواره اي:
بعد از کوبیدن نمونه با ازت مایع بافر استخراج شامل - 20mM CaCl2-50mM sodium acetate - به آن اضافه شده و پس از ورتکس، یک ساعت در 4 درجه نگه داشته شدندبعد. از سانتریفیوژ، مایع رویی را در یخچال نگه می داریم و مجدداً روي پلت حاصل بافر ریخته و مرحله قبل را تکرار می کنیم. در نهایت به مایع جدا شده از پلت، محلول استون/متانول%10 اضافه و 12 ساعت در دماي -20 رها می کنیم. بعد از سانتریفیوژ رسوب پروتئینی که ایجاد می شود را در بافر اوره حل کردیم. در روش دیگري از بافر اوره براي استخراج پروتئین دیواره استفاده شد.
اجراي الکتروفورز دو بعدي: براي اجراي الکتروفورز دو بعدي، مقدار 70 میکروگرم پروتئین بر روي ژل آکریل آمید تحلیلی بارگذاري شد. نوارهاي 17 - IPG سانتی متر، 3 pH تا 10، غیر خطی - به مدت 16 ساعت در دماي اتاق در بافر rehydration قرار داده شدند. بعد اول - IEF - با ولتاژ نهایی 60000 ولت ساعت اجرا گردید. نوارهاي IPG بر روي ژل SDS-PAGE %12 قرار داده شد و در نهایت نقاط پروتئینی با استفاده از روش رنگ آمیزي نیترات نقره قابل مشاهده شدند.
آنالیز ژل:
بعد از اسکن ژلهاي تحلیلی، با استفاده از نرم افزار Melanie 4 - GeneBio, Geneva, Switzerland - مراحل تحلیل اجرا شد. مقایسه کمی نقاط پروتئینی بر اساس درصد حجمی آنها صورت گرفت.
آنالیز آماري ژل:
اطلاعات آماري بیان با استفاده از نرم افزار MSTATC تحلیل شد. این تحلیل بر اساس ANOVA یک طرفه و مقایسه میانگین با استفاده از روش حداقل تفاوت معنی دار - LSD - در سطح 5 درصد انجام شد.
بحث و نتیجه گیري
دیواره هاي جدا شده، دو روش مختلف استخراج پروتئین هاي دیواره اي با بافرهاي استخراج بر پایه کلرید کلسیم و اوره را تجربه کردند. با این روش ها قادر به استخراج پروتئین هاي دیواره اي هستیم که به طور ضعیف و از طریق پیوند هاي واندروالس هیدروفوبیک، هیدروژنی و یا پیوندهاي یونی با دیواره سلولی در ارتباطند. روي هر نمونه دیواره دو روش استخراج پروتئین اما با ترتیب هاي مختلف تست شد
