بخشی از مقاله
چکیده
پیام هاي درونی و بیرونی حاصل از ریزوسفر منجر به الگوي افتراقی بیان ژن در بافتهاي مختلف ریشه اي می گردد. اعمال تیمار شوري بر روي انشعابات مختلف ریشه اي در شرایطی که روابط درونی اندام هاي گیاهی در نظر گرفته نشود رویکرد موثري در تفکیک ارزش اندام ها در سطح تحمل گیاه به متغیرهاي محیطی خواهد بود. مطالعه حاضر به منظور ارزیابی مقایسه اي انشعابات مختلف ریشه اي در پاسخ به تنش شوري و تعیین الگوي بیان ژنهاي این انشعابات با حذف اثرات درونی و برهمکنش آنها اجرا شد. بدین منظور ریشه هاي گیاهچه اي در دو گروه ریشه اصلی و ریشه هاي جانبی تفکیک و در محیط کشت ارگان در حضور 3 سطح شوري 0 - ، 50 و 100 میلی مولار سدیم کلراید - قرار داده شدند.
پس از گذشت 7 روز و تعیین الگوي بیان ژن با استفاده از سیستم الکتروفورز دوبعدي امکان آنالیز بیان افتراقی ژن در شرایط ارایه شده، فراهم شد. اطلاعات به دست آمده نشان داد الگوي بیان ژن در ریشه اصلی و انشعابات فرعی متمایز می باشد. با افزایش میزان NaCl، تعداد پروتئین هایی که افزایش بیان نشان می دهند، در ریشه اصلی کاهش یافته و در ریشه هاي فرعی افزایش می یابند وجود چنین الگویی نشان می هد، سیگنال هاي دریافتی از محیط و درك تنش شوري توسط ریشه هاي قدیمی و انتقال آنها به ریشه هاي جدید، ریشه هاي جوان را براي مواجه با تنش هاي محیطی آماده می کند.
کلمات کلیدي: انشعابات ریشه اي، بیان ژن، پروتئین هاي پاسخ گو به شوري
مقدمه
پیام هاي درونی و بیرونی حاصل از فضاي ریزوسفر منجر به الگوي افتراقی بیان ژن در بافتهاي مختلف ریشه اي می گردد. الگوي نمویی ریشه به مقدار زیادي تابع شرایط محیطی است، به گونه اي که از یک روند دینامیک تبعیت می کند و بر این اساس، شرایط غالب می تواند منجر به تغییر و تعیین کارکرد آن شود . - Muller and Schemidt, 2004 - وجود هتروژنی مکانی و زمانی می تواند خصوصیات اپی ژنتیک و نهایتاً تمایز سلولهاي ریشه اي را کنترل نماید.بخش هاي متفاوت سیستم ریشه اي گیاه در پاسخ به سیگنال هاي محیطی به طور متفاوت عمل می کنند . - Waisel & Eshel, 1991 - هر یک از بخش هاي این سیستم و هر یک از انواع ریشه ها توانایی ویژه اي در تامین نیازهاي آبی، غذایی و یا دریافت مواد مورد نیاز براي رشد شاخساره دارند . - Aloni & Griffith, 1991 -
سیستم ریشه از بخش هایی تکراري تشکیل شده اند که از لحاظ فیزیولوژیکی به شکل واحدهایی خودمختار عمل می کنند. وجود این تنوع در انشعابات ریشه اي مشخصه وراثتی تمامی سیستم هاي ریشه بوده و از اهمیت زیادي در شرایط غیر یکنواخت محیطی برخوردار است به طوري که هر یک از گروه هاي ریشه اي در قابلیت تامین نیازهاي آبی و غذایی کل شاخساره یا بخش هایی از آن به طور متفاوت عمل می کنند - Grime, 1979 ; Varney et al., . - 1991 الگوي بیانی وابسته به مکان و زمان در بافت ریشه اي در تعدادي از خانواده هاي ژنی به چشم می خورد. KNAT
- Truernit et al., 2006 - و - Uehara et al., 2007 - Aux/IAA
مثال هایی از دو خانواده ژنی می باشند که در باره آنها مطالعاتی صورت گرفته است. بیان ژن KNAT6 در ریشه هاي اولیه و بالغ ثانویه مشابه بوده و 2 تا 3 روز پس از جوانه زنی آغاز می شود و مشخص شده که کاهش بیان در KNAT6 با افزایش تعداد ریشه هاي جانبی هم بستگی دارد . - Truernit et al., 2006 - Dean et al., 2006 در مطالعات خود نشان داده است که بیان ژن هاي KNAT4 و KNAT5 در ریشه هاي بالغ کاهش می یابد. همچنین بیان KNAT1 از مرحله IV نمو ریشه هاي جانبی آغاز می شود - Malamy and Benfey, 1997 - ، در حالیکه بیان این ژن در سلول هاي دایره محیطیه ریشه اصلی ضعیف است . - Truernit et al., 2006 - بیان ژن IAA18 از نظر مکانی تنها در سلول هاي دایره محیطیه بوده و از نظر زمانی، تنها در مراحل اولیه نمو ریشه هاي جانبی تشخیص داده شده است، در حالی که در ریشه هاي اولیه بیان نمی گردد.
از طرفی دیگر، IAA14 تشکیل ریشه هاي جانبی را سبب شده و تا حدي براي تشکیل ریشه هاي موئین مورد نیاز است . - Uehara et al., 2007 - مثال هاي فوق به خوبی نشان می دهند که بیان افتراقی ژنها که وابسته به مکان و زمان می باشند، بر روي کارایی ریشه اثرگذار خواهند بود. استفاده از روش هاي با کارایی بالا براي کشف شبکه هاي ژنی در حال توسعه بوده تا اطلاعات بیولوژیکی جامعی را در اختیار قرار دهند. به کار گیري روش هاي پروتئومیکس یکی از این روش ها به شمار می رود با توجه به عدم اطلاع کافی از دینامیک بیان ژن در انشعابات مختلف ریشه اي در گیاه برنج مطالعه حاضر براي ارزیابی تنوع بیان ژن در دو انشعاب ریشه اي گیاهچه برنج در شرایط تنش شوري ارایه گردیده است.
مواد و روش ها
کشت گیاه: بذر برنج - Oryza sativa, cv. IR651 - از موسسه بین المللی تحقیقات برنج - IRRI - دریافت و در شیشه هاي حاوي محیط کشت N6 بدون هورمون و آگار 0/6 درصد کشت داده شد.گیاهچه ها در اتاق رشد با دماي 27 درجه روز و 25 درجه شب، دوره نوري 16 ساعت و رطوبت نسبی 70 درصد نگهداري شدند. استقرار سوسپانسیون اندام و اعمال تیمار: پس از گذشت 13 روز گیاهچه هاي برنج برداشت و ریشه هاي اصلی و جانبی آنها در شرایط استریل از یکدیگر تفکیک شد. ریشه ها به طور مجزا به محیط کشت سوسپانسیون اندام - محیط N6 بدون Melanie 4 - GeneBio, Geneva, Switzerland - مراحل تحلیل هورمون، سوکروز 3 درصد - منتقل شدند. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تیمارهاي 0، 50 و 100 میلی مولار سدیم کلراید در 3 تکرار اجرا شد. ریشه ها در شیکر با دماي 27 درجه و 145دور در دقیقه در تاریکی نگهداري شدند. پس از 7 روز از آغاز تیمار دهی، ریشه ها براي آنالیز پروتئوم برداشت و بلافاصله در ازت مایع قرار داده شدند.
استخراج پروتئین: نمونه هاي ریشه اي با استفاده از روش TRIzol بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده مورد استخراج کل پروتئینهاي محلول قرار گرفتند . - Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH - تعیین غلظت پروتئین: غلظت پروتئین با استفاده از کیت آزمون بردفورد - BioRad, Hercules, CA, USA - و با استفاده از پروتئین BSA به عنوان استاندارد تعیین شد. اجراي الکتروفورز دو بعدي: براي اجراي الکتروفورز دو بعدي، مقدار 70 میکروگرم پروتئین بر روي ژل آکریل آمید تحلیلی بارگذاري شد. نوارهاي 18 - IPG سانتی متر، 4 pH تا 7، خطی - به مدت 16 ساعت در دماي اتاق در بافر rehydration قرار داده شدند. بعد اول - IEF - با ولتاژ نهایی 60000 ولت ساعت اجرا گردید. نوارهاي IPG بر روي ژل SDS-PAGE %12 قرار داده شد و در نهایت نقاط پروتئینی با استفاده از روش رنگ آمیزي نیترات نقره قابل مشاهده شدند.
تحلیل ژل: بعد از اسکن ژلهاي تحلیلی، با استفاده از نرم افزار اجرا شد. مقایسه کمی نقاط پروتئینی بر اساس درصد حجمی آنها صورت گرفت. تحلیل آماري ژل: اطلاعات آماري بیان با استفاده از نرم افزار MSTATC تحلیل شد. این تحلیل بر اساس ANOVA یک طرفه و مقایسه میانگین با استفاده از روش حداقل تفاوت معنی دار - LSD - در سطح 5 درصد انجام شد.
