بخشی از مقاله
چکیده :
این مطالعه با هدف ارزیابی کمی و کیفی پروتئینهاي ترشح شده توسط اندومتریوم و تغییرات پروتئینها در طول سیکل استروس انجام شده است.30 دستگاه تناسلی گاوهاي ماده سالم چند شکم زائیده از کشتارگاه جمع آوري گردید.
با بررسی ساختارهاي موجود در تخمدان و وضع ظاهري رحم، مرحله چرخه استروس تعیین و براي هر نمونه ثبت گردید. دیواره رحم نمونه هاي مورد مطالعه برش داده شده و با یک کورت مایع رحمی جمع آوري گردید.نمونه هاي مایع رحمی همراه با مارکرهاي استاندارد پروتئینی با استفاده از ژل پولی آکریل آمید - SDS PAGE - تجزیه شده و وزن ملکولی باندهاي جداشده بر اساس مارکرهاي پروتئینی ارزیابی گردید
در الکتروفورز در مایع رحمی با ژل پلیآکریلامید باندهاي پروتئینی با Ma/b برابر 0/06 ، 0/42 ، 0/68 ، 0/89 ، 1/36 ، 1/52 و 1/79 تشخیص داده شد. وزن ملکولی تقریبی این پروتئینها که با نشانگر - Marker - تعیین گردید به ترتیب 330 هزار، 160 هزار، 90 هزار، 74 هزار، 40هزار، 30 هزار و کمتر از 14 هزار دالتون بود. از یافته هاي فوق می توان نتیجه گیري نمود که اجزاء پروتئینی تشکیل دهنده مایع رحمی در طول سیکل استروس از نظر کمی و کیفی متغیر بوده و نتیجه این تغییرات، سازگاري رحم براي شرایط فیزیولوژیک خاص می باشد.
مطالعات کاملتر براي ارزیابی پروتئینها مورد نیاز می باشد تا نقش دقیق این مواد در تولید مثل گاو مشخص شود.
مقدمه:
رحم در بیولوژي تولیدمثل پستانداران داراي نقش محوري میباشد. سازگاري رحم گونههاي زندهزا براي پذیرش جنین نسبت به رحم گونههاي تخم گذار به دلیل تغییراتی است که در آن بوجود آمده است. این تغییرات شامل ایجاد محیطی است که براي رشد رویان و فتوس مناسب باشد؛ این محیط با سنتز و ترشح موادي از اندومتریوم رحم به وجود میآید. اندومتریوم محیط واحد هموژن نمیباشد بلکه داراي چند جمعیت سلولی مختلف است . - 4 - مایع دستگاه تناسلی در گونههاي مختلف براي ظرفیت پذیري اسپرم، لقاح و رشد رویان اولیه که اصطلاحاً هیستوتروف نامیده می شود ، داراي اهمیت زیادي است
این امر در تمام گونههایی که داراي جفت غیرتهاجمی میباشند ، بخصوص در نشخوارکنندگان که روند اتصال رویان و تشکیل جفت کندتر از سایر گونهها میباشد، اهمیت بیشتري مییابد ، ترکیب این ترشحات با سرم فرق دارد - 6 و . - 8 اطلاعاتی که منجر به اثبات این امر گردید از بررسی هاي انتقال جنینی به دست آمد که روسا و مورو در سال 1966 و راوسون و همکاران در سال 1972 انجام دادند. آنها متوجه نیاز شدید به همخوانی نوع ترشحات و وجود همزمان آنها براي همزمان کردن سیکل بین دهندهها و گیرندهها در انتقال جنین شدند
نتایج فوق بیانگر این است که محیط رحمی به سرعت در حال تغییر می باشد، تغییراتی که رحم در طول سیکل استروس پیدا می کند موجب مهیا شدن محیطی بسیار اختصاصی براي لقاح تخم می شود
علاوه بر این، تغییر در ترکیبات مایع رحمی براي بقاء رویان نیز اهمیت حیاتی دارد . - 5 - همچنین مایع رحمی داراي چندین سیستم دفاعی فعال مثل کموتاکسین ها و ایمونوگلوبولین ها می باشد
تحقیقات اولیه اي که روبرت و پارکر در سال 1974 و لاستور در سال 1977 انجام دادند منجر به کشف پروتئین ها در ترکیبات مایع رحمی گاو گردید. روبرت و پارکر در سال 1974 براي اولین بار رحم گاو را شستشو داده و توانستند پروتئین هاي آن را استخراج نمایند، آنها به تغییرات سیکلیک اشاره نکرده اند
مشخص کردن وزن ملکولی پروتئینها، اولین قدم تشخیصی یک پروتئین بوده و بر اساس آن می توان مشخصات و عملکرد آن پروتئین را حدس زد. هدف از این مطالعه تخمین زدن وزن ملکولی پروتئین هاي موجود در ترشحات رحمی و همچنین تغییرات این پروتئینها در طول مراحل مختلف سیکل استروس می باشد.
مواد و روش کار:
الکتروفورز بر روي ژل - SDS-PAGE سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل الکتروفورزیز :پروتئینها در روش فوق مطابق با روشی که دیویس در سال - 3 - 1964 و آکروید درسال - 2 - 1967 توصیف نموده اند با استفاده از شرایط مهاجرت به طرف آند - pH=8.9 - انجام شد
نمونه هاي مایع رحمی به نسبت 1 حجم نمونه با 5 حجم بافر نمونه رقیق نموده و آنرا به مدت 15 دقیقه در دماي 100 – 95 درجه سانتیگراد انکوبه می گردد.میزان مفید پروتئین براي یک شان ده خانه اي 0/5 – 0/05 میلی گرم در هر خانه با حجم کلی 10 – 100 میکرولیتر می باشد.
همچنین می توان براي هر 100 میکرو لیتر نمونه، 100 میکرو لیتر از محلول آبی بروموفنل به عنوان معرف رنگی براي ارزیابی میزان مهاجرت نمونه بر روي ژل اضافه نمود. از هر نمونه آْماده شده به میزان 5 میکرولیتر به هر خانه بر روي پلیت الکتروفورز افزوده می شود.
در این مطالعه از دو نوع نشانگر با وزن مولکولی بالا67000 - 1 تا بیش از 330000 دالتون - و پائین14400 - 2 تا 94000 دالتون - استفاده شده است. مارکرهاي پروتئینی مورد استعمال ساخت شرکت LKB – Pharmacia می باشند. الکتروفورز با ولتاژ 200 ولت و با شدت جریان 15 میلی آمپر براي هر پلیت و زمانی در حدود 2 – 1 ساعت - تا زمانیکه رنگ نشانگر بروموفنل آبی تا 1 سانتی متري لبه انتهایی ژل تغییر مکان دهد - انجام می پذیرد.
متعاقب اتمام زمان الکتروفورز ژل ها از تانک خارج گشته به مدت حداقل 3 ساعت در محلول رنگامیزي کوماسی بلو قرار داده می شود سپس به منظور حذف رنگ اضافی از حمام هاي رنگ زدا استفاده می گردد. عمل رنگ زدایی تا حذف کامل رنگ اضافی و سفید شدن زمینه پلیت ها ادامه می یابد.
پلیت ها در هواي گرم و یا در آون در دماي کمتر از 70 درجه سانتیگراد خشک می گردند. به منظور شناسایی پروتئین ها و ارزیابی درصد و میزان هر یک از پروتئین ها از دستگاه دنسیتومتر Sebia Performance ساخت کشور فرانسه - طول موج 570 نانومتر و فیلتر زرد - استفاده گردید. منحنی هاي مربوط به میزان مهاجرت پروتئین هاي مایع رحم و کیت هاي کالیبراسیون ترسیم و مورد مقایسه قرار گرفتند. میزان 3 R f پروتئینهاي مجهول محاسبه و سپس وزن مولکولی آنها با استفاده از منحنی کالیبراسیون تعیین گردید.
مسافت طی شده توسط رنگ از مبدا
بررسی آماري: داده هاي حاصل از نمونه هاي مورد مطالعه ، با کمک برنامه آماريSPSS 10 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت . براي بررسی چگونگی ارتباط داده هاي مربوط به نمونه هاي مایع رحمی و سرم در مراحل مختلف چرخه استروس ار آنالیز واریانس ، آنواي یک طرفه ،تست Tukey استفاده و معنی دار بودن تفاوتها با P<0.05 محاسبه گردید .
نتیجه و بحث:
نتایج حاصل از بررسی الکتروفورز پروتئین هاي مایع رحمی گاو بر روي ژل هاي پلی اکریل آمید نشان داد که باند هاي پروتئینی شامل باندهاي 0/06، 0/42، 0/68، 0/89، 1/36، 1/52، Ma/b= 1/79 - اصطلاح Ma/b طبق گزارشات روبرت و همکاران - 1976 - براساس حرکت پروتئین ها در مقایسه با انتهاي باند آلبومین محاسبه می شود - . - 9 - در تر شحات رحمی وجود دارد.وزن مولکولی تقریبی پروتئین هاي موجود در ترشحات رحمی در مراحل مختلف در قیاس با مارکرهاي پروتئینی محاسبه گردید. وزن مولکولی تقریبی پروتئین هاي جدا شده به ترتیب عبارتند از 330000، 160000، 90000، 74000، 67000، 40000، 30000، کمتر از 14000 دالتون
باند پروتئین با وزن کمتر از 14400دالتون تنها در مرحله مت استروس مشاهده شد. آلبومین در تمام مراحل قابل مشاهده بود.باند داراي وزن 60-50 کیلو دالتون تنها در مرحله داي استروس قابل مشاهده بود. باند پروتئین با وزن 88100دالتون تنها در مرحله داي استروس مشاهده نشد - تصویر شماره - 4-11 باند پروتئین با وزن کمتر از 14400دالتون تنها در مرحله مت استروس مشاهده شد.
آلبومین در تمام مراحل قابل مشاهده بود.باند داراي وزن 60-50 کیلو دالتون تنها در مرحله داي استروس قابل مشاهده بود. باند پروتئین با وزن 88100دالتون تنها در مرحله داي استروس مشاهده نشد. - منحنی استاندارد Rf نمونه هاي الکتروفورز شده در تصاویر شماره 1 و 2 آمده است.
تصویر شماره : 1 مقایسه منحنیهاي الکتروفورزي حاصل از ا لکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید در مراحل مختلف چرخه استروس با مارکرهاي پروتئینی
تصویر شماره :2 تصویر منحنی استانداردRf مارکرها و پروتئین رحم
