بخشی از مقاله
چکیده
ارزیابی ژنتیکی ژن اعاده کننده باروري براي نر عقیمی نوع WA در برنج با استفاده از لاین نر عقیم سیتوپلاسمی IR58025A در ترکیب با آمل- 2 مورد مطالعه قرار گرفت. در این مطالعه تعداد 270 بوته از جمعیت F2 حاصل از تلاقی - آمل- 2 - IR58025A× به طور تصادفی انتخاب و درصد باروري یا عقیمی این گیاهان مورد مطالعه قرار گرفت. نسبت باروري خوشه دار گیاهان نسل F2 به صورت 143 گیاه بارور، 61 گیاه نیمه بارور، 55 گیاه نیمه عقیم و 11گیاه کاملاً عقیم بودند.
ارزیابی باروري در جمعیت F2 نشان داد که صفت اعاده باروري در رقم آمل 2 توسط 2 ژن غالب کنترل می شود. در این مطالعه تعداد 11 نشانگر SSR مورد استفاده قرار گرفت. نشاگرهاي RM294، RM269، RM258، RM237، RM3510 چندشکلی ندادند و نشانگرهايRM311، RM302، RM304، RM490، RM580، RM243، RM23،RM228 و RM244 چندشکلی نشان دادند. مطالعات نشان می دهد که ژن باروري RF3 با نشانگرهاي RM243 و RM490 روي کروموزوم یک پیوستگی داشته است و با استفاده از آموي کاي اسکور دوژنی بودن تأیید میشود.
مقدمه
برنج به عنوان یکی از مهمترین محصولات کشاورزي در جهان به حساب می آید و نیز یک غذاي مناسب در جمعیت قاره آسیا می باشد. بیش از 90 درصد برنج دنیا در آسیا تولید شده و به مصرف می رسد و بیش از نصف برنج آسیا در کشورهاي هند و چین تولید می شود. برنج هیبرید فرصتی را براي افزایش پتانسیل عملکرد برنج فراهم می نماید - . - 9 عملکرد برنج هیبرید 20%-15 بیشتر از واریته هاي بومی با عملکرد بالا می باشد
نر عقیمی سیتوپلاسمی CMS - WA1 و سیستم اعاده کننده باروري براي گسترش و تجارتی نمودن این تکنولوژي بسیار کارامد می باشند. نر عقیمی سیتوپلاسمی پدیده اي معمول در گیاهان می باشد که به طور گسترده به منظور ممانعت از خود گرده افشانی جهت تولید بذور هیبرید در محصولات مختلف به کار گرفته می شود - . - 8 در برنج هیبرید از سیستم سه لاینی متشکل از لاین اعاده کننده باروري، لاین نر عقیم و نگهدارنده باروري استفاده می شود. اولین واریته هیبرید سال 1965 معرفی شد
از آنجا که برنج گیاهی خود گشن است به منظور انجام دگر گشنی در آن از سیستم نر عقیمی سیتوپلاسمی استفاده می شود به طوري که لاین نر عقیم قادر به تولید دانه گرده بارور نمی باشد . - 8 - بیش از 20 منبع CMS مختلف در برنج شناسایی شده است ولی در بین آنها نرعقیمی سیتوپلاسمی نوع WA داراي فراوانی بالاتري بوده و اکنون صنعت تولید بذر هیبرید برنج حدود 90 درصد وابسته به این منبع نرعقیمی می باشد . - 1 - CMS صفتی با وراثت مادري می باشد که بر اثر اختلال یا بازآرایی ژنوم میتوکندریایی و در نتیجه ناتوانی در تولید دانه هاي گرده بارور و فعال ایجاد می شود. اما به کمک ژن هاي تجدید کننده باروري - ژن هاي - Rf می توان باروري را به لاین هاي نرعقیم سیتوپلاسمی بازگرداند
سیتوپلاسم بدست آمده از برنج وحشی که به نرعقیمی سیتوپلاسمی تیپ وحشی معروف است به صورت اسپوروفیتی به ارث می رسد و بنابراین این نوع نرعقیمی سیتوپلاسمی کاربرد وسیعی در تولید لاین هاي جدید CMS دارد که در برنامه هاي اصلاحی برنج هیبرید قابل استفاده هستند
نشانگرهاي SSR ابزار مناسبی را براي تهیه نقشه ژنتیکی و انتخاب به کمک نشانگرهاي مولکولی را فراهم می کنند. هدف اصلی این مطالعه تعیین تعداد ژن کنترل کننده باروري براي نرعقیمی نوع WA در رقم آمل-2 و شناسایی نشانگرهاي مولکولی همبسته با ژن باروري و مشخص کردن فاصله این نشانگرها از ژن باروري مربوط می باشد.
مواد و روشها
در این مطالعه از جمعیت F2 حاصل از تلاقی IR58025A و آمل - 2، شامل 270 گیاه که به طور تصادفی انتخاب شده بودند استفاده شد. درصد باروري دانه گرده و میزان تشکیل بذر به عنوان معیارهاي مهم براي ارزیابی گیاهان بارور و عقیم مورد استفاده قرار گرفتند. براي تجزیه باروري گرده، خوشه از پنجه اصلی انتخاب شده است. سه گلچه به طور تصادفی از قسمت هاي مختلف روي هر خوش انتخاب شد.
بساك هاي هر گلچه در محلول یک درصد - I2-IK - روي لام به طور جداگانه له شده و میزان باروري با استفاده از میکروسکوپ مورد مشاهده قرار گرفت. گیاهان به گروه هاي مختلف بارور برا اساس نسبت دانه هاي رنگ گرفته و تعداد دانه گرده بارور به تعداد کل دانه گرده مشاهده شده ضرب در صد طبقه بندي شدند. با توجه به باروري دانه گرده، گیاهان نسل F2 به کلاس هاي زیر طبقه بندي شدند. گیاهان F2در انواع کاملاً قیمع - - < 5، جزئی عقیم - - 49-5، جزئی بارور - - 86 -50 و - > 86 - کاملاً بارور تقسیم شدند.
شایستگی نسبت الگوي تفکیک مندلی گیاهان بارور، نیمه بارور، نیمه عقیم و کاملاً عقیم در گیاه F2 با استفاده از آزمون کاي اسکور مورد بررسی قرار گرفت. سپس گیاهان مورد بررسی ژنومی قرار گرفتند.
استخراج DNA
براي استخراج DNA ژنومی گیاهان از روش CTAB تغییر یافته استفاده گردید . - 5 - واکنش زنجیره اي پلی مراز2 طبق روش ستاري - 2008 - انجام گرفت. از محصولات پی سی ار را با ژل آگارز 2 درصد و اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي شده و سپس براي تفکیک باندي در پلی اکریل آمید 6 درصد برده شدند . تعداد بیست نشانگر در جمعیت F2 براي مشاهده چند شکلی آزمایش شده اند. براي تجزیه تک نشانگر، فراوانی نوترکیبی بین نشانگر مثبت و مکان - هاي - Rf از طریق برآورد کننده حداکثر درستنمایی محاسبه خواهد شد
نتایج و بحث
تفکیک باروري جمعیت F2 آمل- IR58025A × 2 شامل 143 گیاه بارور، 61 گیاه نیمه بارور، 55 گیاه نیمه عقیم و 11 گیاه کاملاً عقیم بوده است که براي فهمیدن چند ژنی بودن از آزمون کاي اسکور استفاده شد که نسبت نشان دهنده این است که صفت مورد نظر اعاده کننده باروري دوژنی است و دو ژن غالب و به طور مستقل از هم هستند.
نمودار -1 توزیع فراوانی فنوتیپی درصد باروري در جمعیت F2 - آمل- - IR25A × 2
براي تشخیص ژن هاي باروري در آمل- 2 آغازگرهاي SSR3 براي غربال گري چند شکلی در جمعیت گیاهان حاصل از - آمل- - IR58025A × 2 انتخاب شدند. از میان آغازگرهاي مورد استفاده RM302، RM490، RM580، RM243، RM23 روي کروموزوم 1 و نیز آغازگرهاي RM311، RM304، RM228، RM244 روي کروموزوم 10 چندشکلی نشان دادند.
آزمون کاي اسکور همبستگی داده هاي ژنومی آغازگرهاي مورد استفاده را براي مکان Rf3 روي کروموزوم 1 و آغازگرهاي مورد استفاده را براي مکان Rf4 تأیید کرد. آغازگرهاي RM228، RM244 روي کروموزوم 10 نسبت 1:2:1 معنی دار نشده که نشان دهنده همبستگی این نشانگر با مکان هاي ژنی Rf3 و Rf4 روي کروموزوم 1 و 10 می باشد و نیز اینکه نسبت نوترکیبی میان نشانگر RM243 و ژن باروري بدست آمده است 20 درصد محاسبه شده است.
ستاري و همکاران - 2008 - در سیستم CMS – WA فاصله ژن Rf3 را از نشانگر RM490، 2/8 سانتی مورگان مشخص کردند. تعیین نشانگرهاي کاملاً پیوسته براي استفاده MASمی تواند قابل استفاده باشد و نهایتاً در کلون بر اساس نقشه ژن باروري کمک می کند - . - 2 براي مثال نشانگر RM490، RM243 می توانند قابل استفاده در غربال براي بازگرداندن باروري در سیتوپلاسم WA باشند.
شکل الف- قطعات باندي حاصل از نشانگر RM243 با جمعیت آمل- IR58025A × 2
