بخشی از مقاله
چکیده
در قالب طرح ملی تهیه شناسنامه ژنتیکی ژرم پلاسم بادام اهلی ایران تعدادي از ارقام و ژنوتیپ هاي بادام کشور با استفاده از نشانگرهايمولکولی SSR مورد بررسی قرار گرفت. در فاز اول این مطالعه تعداد 170 ژنوتیپ و 9 نشانگر SSR اختصاصی بادام استفاده گردید. در مطالعاتمولکولی با توجه به استفاده از نشانگرهاي SSR اختصاصی بادام، بطور متوسط تعداد آلل - 16 - ، تعداد آلل موثر - 5.74 - و در کل میزان پلی مورفیسمبیشتري - نسبت به بررسی هاي مشابه که از SSR هاي گونه هاي خویشاوند استفاده نموده اند - به ازاي هر جایگاه بدست آمد و میانگینهتروزیگوسیتی - 0/8 - نیز در میان ژنوتیپ هاي مورد بررسی بالاتر بود. داده هاي مولکولی از طریق روشهاي فنتیکی PCO - و تجزیه کلاستر - وبراساس معیارهاي رایج فا صله - نی - و تشابه در میان ژنوتیپها بررسی شده و پارامترهاي مورد نظر ارزیابی گردید. گروهبندي ژنوتیپها برا ساس دادههاي مولکولی انجام گردید. نتایج حاصل در ژرم پلاسم مورد بررسی از لحاظ انتخاب سریع و دقیق ژنوتیپ هاي مورد نظر و مدیریت منابع ژنتیک گیاهی می تواند مورد توجه قرار گیرد.
کلمات کلیدي: بادام، شناسنامه ژنتیکی، نشانگرهاي مولکولی
مقدمه
بادام یکی از قدیمی ترین و مهمترین محصولات باغبانی در ایران است. ایران به دلیل شرایط آگروکلیمایی مناسب، یکی از مراکز مهم پرورش بادام هاي اهلی و وحشی در دنیا به شمار می رود. صادرات خشکبار و به ویژه بادام علاوه بر ارزآوري و تقویت اقتصاد کشور منبع عمده درآمد براي تولیدکنندگان آن به شمار می رود و گاهی معیشت باغداران صرفاً به تولید این محصول وابسته است. به طور سنتی شناسایی ارقام بادام با استفاده از صفات مورفولوژیکی صورت می گرفته است. ازجمله محدودیت هاي استفاده از صفات مورفولوژي این است که چنین صفاتی همیشه در دسترس نبوده و تحت تاثیر محیط قرار می گیرند و نیز بعضا مشاهده آنها نیازمند به رسیدن گیاه به مرحله بلوغ می باشد.
براي حل چنین مشکلاتی، نشانگرهاي مولکولی امکان ایجاد تمایز بین ارقام و ژنوتیپ ها را بدون تاثیر پذیري از محیط و با دقت و سرعت قابل توجهی براي مطالعات تنوع، مشخص نمودن شجره نامه ها و یا شناسایی ارقام فراهم نموده است. تاکنون نشانگرهاي مختلفی از جمله آیزوزایم ها، RFLPs، RAPDs، AFLPs، SSRs و غیره بدین منظور توسعه یافته اند. نشانگرهاي SSR یا ریز ماهواره که مبتنی بر تکنیک PCR می باشند، بدلیل پلی مورفیسم زیاد، فراوانی و توارث هم بارز، براي انگشت نگاري DNA، بررسی تنوع ژنتیکی درون گونه اي و بین گونه هاي خویشاوند، در بسیاري از گونه هاي گیاهی مورد استفاده قرار گرفته اند.
مواد وروش ها
مواد گیاهی: تعداد 170 ژنوتیپ بادام اهلی از کلکسیون مرکز تحقیقات کشاورزي و منابع طبیعی استان اصفهان و کلکسیون ایستگاه تحقیقات باغبانی کمال آباد انتخاب و نمونه هاي برگی جوان جهت استخراج DNA به آزمایشگاه منتقل گردید.
استخراج :DNA برگ هاي جوان این گیاهان پس از جمع آوري و آماده سازي، تا زمان استخراج DNA در تاریکی و دماي4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. به دلیل وجود متابولیت هاي ثانویه زیاد در برگ هاي این گیاه، هیچ کدام از روش هاي موجود براي استخراج DNA مناسب نبود. استخراج DNA با استفاده از روش بهینه سازي شده براي بادام - 4 - از نمونه هاي برگی صورت گرفت. در این روش از بافراستخراج حاوي 1/4M Nacl، 100mM Tris-HCl، 20mM EDTA - pH=8 - ، SDS %1، PVP %1، -2 مرکاپتواتانول %1 - که بلافاصله قبل ازاستفاده به بافراستخراج اضافه شد - و 3-2 بار استخراج بوسیله کلروفرم:ایزوآمیل الکل - 1:24 - استفاده گردید.
شرایط PCR و الکتروفورز فرآورده هاي تکثیرشده: در مجموع از 9 نشانگر SSR اختصاصی بادام - 6 - - جدول - 1 به منظور انجام مطالعات مولکولی استفاده گردید. واکنش هاي PCR در حجم 15ʽl و شامل بافر PCR - 1x - ، dNTPs - 0.2mM - ، آغازگرها - هر کدام - 0.05ʽM، آنزیم پلیمراز - 0.15 U - Taq و DNA ژنومی - 10-20 ng - بود.واکنش هاي PCR با استفاده از یک دستگاه ترمال سایکلر BioRad و با چرخه هاي دمایی زیر صورت گرفت: یک چرخه به صورت 3 دقیقه در 94 °C، سی چرخه به صورت 94°C، 45 ثانیه، دماي اتصال 45 ثانیه و 72°C، 30 ثانیه و نهایتا 72°C به مدت 5 دقیقه.فرآورده هاي تکثیري تا پیش از الکتروفورز در دماي 4°C نگهداري شدند. به منظور جداسازي فرآورده هاي PCR، از ژل اکریل آمید 6 درصد و بافر TAE1x استفاده گردید. ژل ها پس از انجام الکتروفورز با استفاده از محلول اتیدیوم بروماید - 10mg/ml - رنگ آمیزي شده و در زیر نور UV عکس برداري از آنها انجام گردید - شکل . - 1
تجزیه و تحلیل داده ها: اندازه - جفت باز - نوارهاي حاصل با استفاده از یک مارکر وزن مولکولی - M50 - و با استفاده از نرم افزار - v.99 - UVIDoc مشخص گردید. الگوي نواربندي نوارهاي کاملا واضح به صورت 0 و 1 و ژنوتیپ آللی تعیین شد.ماتریس تشابه داده ها بر اساس ضریب شباهت ژاکارد و نی تشکیل و دندروگرام مربوطه - تجزیه کلاستر - به روشUPGMA با استفاده از نرم افزار NTsys 2.02 ترسیم گردید. تعداد و فراوانی هاي آلل ها، میزان هتروزایگوسیتی، شاخص شانون، شباهت و فاصله ژنتیکی نی - 5 - ، با نرم افزار POPGENE 1,32 محاسبه شد.
نتایج و بحث
در مطالعات مولکولی بر روي ژنوتیپ هاي مورد بررسی با توجه به استفاده از نشانگرهاي SSR اختصاصی بادام، بطور متوسط تعداد آلل و پلی مورفیسم بیشتري - نسبت به بررسی هاي مشابه که از SSR هاي گونه هاي خویشاوند نظیر هلو استفاده نموده اند - به ازاي هر جایگاه بدست آمد و میانگین هتروزیگوسیتی نیز در میان ژنوتیپ هاي مورد بررسی بالاتر بود - جدول . - 1 در بین 9 نشانگر SSR مورد استفاده، از دو نشانگر میزان پلی مورفیسم قابل توجهی به دست نیامد که در نتیجه در محاسبات وارد نشدند. نشانگر UDA023 با 19 آلل و میزان 9.79 آلل موثر بیشترین چندشکلی را ایجاد نمود.
بزرگترین شاخص شانون نیز مربوط به نشانگر 23UDA0 به میزان 2.46 بود. با توجه به دندروگرام حاصل، تمامی ژنوتیپ ها به طور قابل توجهی از یکدیگر تفکیک شدند که این نشان دهنده پلی مورفیسم بالاي ژرم پلاسم مورد بررسی و قابلیت تفکیک بالاي نشانگرهاي SSR مورد استفاده می باشد. در میان ژنوتیپ هاي مورد بررسی، تعدادي ژنوتیپ به صورت شاخص مورد شناسایی قرار گرفتند. بدین معنی که با استفاده از آلل هاي خاص امکان شناسایی سریع و مستقیم این ژنوتیپ ها فراهم گردید. تنها با استفاده از 3 جفت پرایمر 005-008-023- امکان تفکیک 167 از 169 ژنوتیپ مورد نظر ژنوتیپ فراهم گردید.
