بخشی از مقاله
چکیده:
هدف از این تحقیق، جداسازي باکتریهاي اپیفیت از شکوفه، برگ و شاخه درختان سالم و آلوده دانه دار و هسته دار باغهاي کرج، اصفهان و نیشابور و بررسی خاصیت آنتاگونیستی آنها علیه E. amylovora در شرایط آزمایشگاهی بود. بدین منظور، از دو آزمون آنتی بیوز و میوه نارس استفاده شد. از میان 120 جدایه باکتري جدا شده، 21 جدایه در هر دو آزمون قابلیت بازدارندگی از رشد باکتري عامل بیماري را داشتند. این جدایهها شامل جنسهاي Pseudomonas، Pantoea ، Serratia، Enterobacter و Bacillus بودند.
از بین آنها، 4 جدایه که داراي بیشترین میزان بازدارندگی در سطح پتري و میوه نارس، رشد زیاد در سطح محیط کشت و پایداري در بازدارندگی بودند، به عنوان آنتاگونیست برتر انتخاب و از طریق آنالیز توالی ژن 16S rDNA شناسایی شدند.
بدین منظور پس از استخراج DNA، ژن rDNA 16S با استفاده از پرایمرهاي P6/P0 تکثیر و باندي به اندازه 1500 جفت باز را ایجاد نمودند. قطعات حاصل به روش اتوماتیک در هر دو جهت سنس و آنتی سنس در کمپانی - Macrogen, Korea - تعیین توالی شدند. پس از همردیف کردن توالیها با سایر توالیهاي مربوط به این نواحی در گونههاي مختلف باکتري موجود در بانک ژن مشخص شد که با شباهت %99 جدایه E10 متعلق به گونه P. fluorescens، جدایه Abp2 به P. agglomerans، جدایه E11 به P. putida و جدایه Kgh1 متعلق به باکتري S. marcescens است.
مقدمه:
بیماري آتشک با عامل باکتریایی E. amylovora، از مهلکترین بیماريهاي درختان میوه دانه دار محسوب میشود که خسارات اقتصادي زیادي را در درختان گلابی، سیب و به در نقاط مختلف کشور ایجاد کرده است. در ایران براي مبارزه با این بیماري، عمدتا از روشهاي شیمیایی - 5 - استفاده میشود که خود این منجر به بروز صدمات دراز مدت زیست محیطی بر اکوسیستم زنده و ایجاد مقاومت در عوامل بیماریزا میگردد . - 9 - از سوي دیگر محدودیتهایی در دستیابی به ارقام مقاوم وجود دارد.
بنابراین کنترل بیولوژیک میتواند جایگزین مناسب و بیخطر در قالب مدیریت تلفیقی محسوب بشود. یکی از آنتاگونیست هاي بسیار معروف که اولین سم بیولوژیکی با نام تجاري بلایت بن A506 علیه باکتري آتشک از آن تهیه شد باکتري P. fluorescens A506 است . - 8 - از دیگر آنتاگونیستهاي مهم مورد استفاده در مبارزه بیولوژیک با آتشک استرین 132 از باکتري P. agglomerans است .
براي شناسایی باکتريها از روشهاي متعدد فنوتیپی از قبیل استفاده از خصوصیات ریخت شناسی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و تغذیهاي استفاده میشود. از آنجایی که این روشها وقت گیر و اغلب نتایج حاصل همراه با ابهام است، استفاده از خصوصیات مولکولی در دو دهه اخیر مورد توجه جدي قرار گرفته است. امروزه با توجه به پیشرفت هاي سریع روي ژنوم باکتريها به ویژه ملکولهاي حافظت شده rRNA امر شناسایی باکتريها دچار تحول شگرف شده است.
ژن 16S rRNA، ژنی از نوع ملکول RNA است که در باکتريها در ساختمان ریبوزوم، به کار رفته است و شامل مناطقی هستتند که به طور خیلی زیاد حفاظت شده و در تمام باکتريها وجود دارند و همچنین شامل مناطق متنوعی هستند که توالی هاي منحصر به فرد در حد جنس و یا گونه دارند. از مناطقی که متنوع هستند میتوان براي تشخیص باکتريها استفاده کرد
مواد و روشها:
جداسازي باکتريهاي آنتاگونیست: نمونههایی از شکوفه، برگ و شاخه درختان میوه هسته دار و دانه دار به آزمایشگاه منتقل و در داخل ارلنهاي استریل حاوي 50 میلی لیتر آب مقطر استریل قرار داده شد. پس از 4 ساعت شیکر، سوسپانسیونها روي محیط کشت کینگ-ب1 کشت گردید. در مجموع حدود 120 جدایه باکتریایی که عمدتا از نوع گرم منفی و غیر فلورسانت بودند جداسازي و براي ارزیابی صفت آنتاگونیستی تحت آزمونهاي مختلف قرار گرفتند.
-1 آزمون آنتی بیوز : - 6 - جدایههاي باکتري به صورت لکهاي روي محیط کشت کینگ-ب کشت و پس از 24 ساعت سوسپانسیون E. amylovora با رقت 107 واحد کلنی در میلیلیتر به سطح پتريها اسپري شد. پس از 2-3 روز با مشاهده هالههاي بازدارندگی اقدام به اندازه گیري نواحی بازدارندگی شد. این آزمون براي چندین بار در طول مدت تحقیق تکرار و ثبات و پایداري بازدارندگی جدایههاي آنتاگونیست مورد سنجش و ارزیابی قرار گرفت.
-2 آزمون میوههاي نارس گلابی: - 2 - 2 میوههاي نارس گلابی پس از ضد عفونی سطحی با محلول %1 هیپوکلریت سدیم به قطعات کوچک تقسیم و هر قطعه در یک ظرف استریل روي کاغذ صافی مرطوب قرار داده شد. چاهکهایی به قطر 4 میلیمتر روي سطوح برشهاي میوه نارس با استفاده از چوب پنبه سوراخ کن استریل، ایجاد گردید. سپس 10 میکرولیتر از سوسپانسیون آنتاگونیستهاي تهیه شده از کشت تازه، با رقت 108 واحد کلنی در میلیلیتر به چاهکها تزریق شد. پس از 3-4 ساعت باکتري E. amylovora با رقت 105 واحد کلنی در میلیلیتر به داخل چاهکها اضافه گردید. براي هر یک از جدایهها یک تیمار شاهد با آب مقطر استریل و یک تیمار شاهد با E. amylovora نیز در نظر گرفته شد. به محض بروز تراوشات باکتریایی در تیمار شاهد تلقیح شده با باکتري E. amylovora خاصیت آنتاگونیستی جدایههاي باکتریایی که بر مبناي آزمون آنتی بیوز انتخاب شده بودند مورد بررسی قرار گرفت.
شناسایی باکتريهاي آنتاگونیست موثر: از روشهاي متداول بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و مرفولوژیکی براي شناسایی آنتاگونیست هاي موثر استفاده شد
شناسایی باکتريهاي آنتاگونیست برتر براساس توالی :16S rDNA براي استخراج DNA از روش لیز قلیایی - 11 - استفاده شد. در ابتدا سوسپانسیون باکتريهاي آنتاگونیست با رقت 107 واحد کلنی در میلیلیتر در 400 میکرولیتر آب مقطراستریل تهیه و پس از اضافه کردن400 میکرولیتر 0/05 NaOH مولار، 15 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد در حمام آبی قرار گرفت. سپس سوسپانسیون به مدت 2 دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و100 میکرولیتر محلول رویی به تیوپهاي استریل منتقل گردید. براي شناسایی جدایهها از پرایمر طراحی شده از ناحیه 16S rDNAP0 - 59- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG - و P6 - 59-CTACGG CTACCTTGTTACGA - استفاده شد .
واکنش زنجیرهاي پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر Bio-RAD مدل MY CYCLER با حجم نهائی 50 میکرولیتر شامل 5 میکرولیتر بافر 10 X، 1 میکرولیتر از هر پرایمر، 0/3 واحد آنزیم Taq پلیمراز، 1/5 میکرولیتر 50MgCl2 میلی مولار، 1 میکرولیتر dNTP mix 10 میلی مولار و 1میکرولیتر از DNA الگو و 38/2 میکرولیتر آب مقطر سترون انجام شد. چرخه گرمایی اولیه در دماي 95° C به مدت 5 دقیقه و 35 چرخه و هر چرخه داراي دماي 95°C به مدت 30 ثانیه براي باز شدن دو رشته DNA، 5 سیکل در 60°C، 5 سیکل در 55°C و 25 سیکل در دماي 50°C به مدت 30 ثانیه براي اتصال آغازگر به DNAوساخته شدن قطعات مورد نظر به مدت 4 دقیقه در دماي 72°C و واکنش انتهایی در دماي 72°C به مدت 10 دقیقه کامل شد. پس از خاتمه واکنش، محصولات واکنش زنجیرهاي پلیمراز 1 روي ژل آگارز 1/2 درصد حاوي محلول اتیدیوم بروماید - با غلظت ا میلیگرم در لیتر - با ولتاژ ثابت 75 ولت به مدت 1/5 ساعت الکتروفورز گردید. از مارکر DNA فاژلامبدا2 براي تعیین اندازه قطعات استفاده شد.
براي تعیین توالی، محصولات واکنش زنجیرهاي پلیمراز به شرکت ماکروژن کره فرستاده شد و تعیین توالی با روش اتوماتیک در هر دو جهت سنس و آنتی سنس و با استفاده از آغازگرهاي مذکور انجام شد. توالیهاي بدست آمده با استفاده از نرم افزار Seqman اصلاح و با به کارگیري برنامه بلاست3، با توالیهاي موجود در بانک ژن همردیف گردیدند .
نتایج و بحث:
پس از اخذ نتایج از دو آزمون آنتاگونیستی و مقایسه نتایج با یکدیگر، از مجموع 120 جدایه باکتریایی 21 جدایه در هر دو روش یاد شده از خود خاصیت آنتاگونیستی نشان دادند و لذا به عنوان جدایههاي موثر آنتاگونیست انتخاب و خصوصیات فیزیولوژي و بیوشیمیایی آنها تعیین گردید. سه جدایه متعلق به جنس Pseudomonas، سه جدایه متعلق به جنس Pantoea ، دو جدایه متعلق به باکتري Serratia، سه جدایه متعلق به Enterobacter و 9 جدایه متعلق به جنس Bacillus میباشد. بعضی از این جدایهها با وجود تشکیل هاله بازدارندگی در شرایط اولیه رشد، به تدریج با کاهش و بعضا با محو کامل هالههاي بازدارندگی در طول انکوباسیون روبرو شدند که از آنها صرف نظر شد.
نتایج حاصل نشان میدهد که بیشترین و متنوعترین آنتاگونیستهاي باکتریایی به ترتیب متعلق به شهرستانهاي کرج، اصفهان ونیشابور بودند. برغم تعداد کمتر آنتاگونیست از منطقه اصفهان این آنتاگونیستها از قدرت بازدارندگی بالائی برخوردار بودند. آنتاگونیستهاي باکتریایی متعلق به شهرستان نیشابور اکثرا متعلق به جنس Bacillus بودند و همچنین فقدان جمعیتهاي قابل توجه آنتاگونیستها و قرار گرفتن آنها به عنوان آنتاگونیستهاي متوسط تا ضعیف میتواند از فاکتورهاي مطرح در توسعه بیماري در این شهرستان باشد. از میان تمام آنتاگونیستها، 4 جدایه به دلیل پایداري قدرت بازدارندگی در تمام طول آزمایشهاي مختلف به عنوان آنتاگونیست برتر شناسایی و به روش واکنش زنجیرهاي پلیمراز و با استفاده از پرایمرهاي P6/P0 شناسایی شدند.
