بخشی از مقاله
چکیده
دراین ﲢقیق تنوع ژنتیکی 19 جدایه باکﱰیایی آنتاگونیست متعلق بهPseudomonas fluorescens و Bacillus subtilis از مزارع برنج آلوده به قارچ Rhizoctonia solani - عامل سوختگی غلاف - و Fusarium monilifrome - عامل پوسیدگی طوقه و ریشه - از استانگیلان جداسازي و شناسایی گردید و سپس با استفاده از نشانگر RAPD موردبررسی قرار گرفت. از ﳎموع 50 آغازگر ده بازي5 آغازگر به علت درصد بالاي چندشکلی در آزمایشات مناسب تشخیص داده شد. به کمک اطلاعات به دست آمده ازنشانگر RAPD و نرم افزار NTSYS جدایه ها گروه بندي شدند. سپس با نرم افزارPOPGENE میزان تنوع ژنتیکی درون گونه اي و نسبت تنوع ژنتیکی توزیع شده درﲨعیت ها بدست آمد. تنوع ژنتیکی بر اساس ضریب Nei براي سه ﲨعیت A , B, C به
ترتیب 0/22 و0 /28و0/29 برآورد شد. در این بررسی کلیه جدایه هاي آنتاگونیست P.fluorescens که از منطقه ریزوسفر برنج جداسازي شده بودند از نظر تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر RAPD با یکدیگر تفاوت داشتند. به نظر می رسد نشانگرهاي RAPD مورد استفاده قرار گرفته در این ﲢقیق ابزار مناسﱯ جهت تفکیک درون گونه اي جدایه هاي آنتاگونیست باشد.
کلمات کلیدي : برنج , تنوع ژنتیکی , باکﱰیهاي آنتاگونیست, RAPD
مقدمه
شناسایی و مطالعه مولکوﱄ عوامل بیولوژیک سبب گردیده است آه راههاي نویﲏ جهت مبارزه موفق با عوامل بیماریزاي گیاهی ابداع گردد. آه از آن ﲨله می توان به افزایش قدرت عوامل آنﱰل بیولوژیک اشاره ﳕود. [7] در ساﳍاي اخﲑ، پیشرفتهاي ﲢسﲔ برانگیزي آه درزمینه زیست شناسی مولکوﱄ و بیوتکنولوژي صورت گرفته، ابزار قدرﲤندي را براي پژوهشهاي ژنتیک فراهم آرده اند. شاید اساسی ترین و مفیدترین این ابزار نشانگرهاي دي.ان.ا باشد.[7] نشانگرهاي RAPD بدلیل عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ردیف دي ان. ا امکان بررسی ﳘزمان چندین جایگاه در ژنوم ﳕونه ها ،عدم نیاز به آاوشگر، سهولت و هزینه آم به سرعت توسط ﳏققﲔ مورد استقبال قرار گرفت. از نشانگر RAPD و نشانگرهاي مرتبط با آن بیشﱰ براي بررسی تنوع ژنتیکی ، ﲥیه نقشه هاي پیوستگی، شناسایی ارقام و رده بندي درون گونه اي و بﲔ گونه اي استفاده می شود. هدف از این ﲢقیق مقایسه مولکوﱄ جدایه هاي آنتاگونیست باآﱰیایی بدست آمده از ریزوسفر برنج در شالیزارهاي آلوده به بیماري سوختگی غلاف برنج و پوسیدگی طوقه و ریشه برنج با استفاده از نشانگر هاي RAPD می باشد.
مواد و روش ها
ﲥیه ﳕونه هاي جدایه هاي آنتاگونیست باآﱰیایی سوختگی غلاف و پوسیدگی ریشه وطوقه برنجدراین مطالعه 19 جدایه باکﱰیایی آنتاگونیست از مزارع برنج آلوده به قارچ Rhizoctonia solani وFusarium monilifrome استان گیلان جداسازي و شناسایی شده بوداستفاده گردید. جدایه هاي آنتاگونیست F1، F6 ، F12 ، F15 ، F16 ، F18 ،F21 و F25 بعنوان Pseudomonas fluorescens جدا شده از مزرعه آلوده به قارچFusarium monilifrome , جدایه هاي آنتاگونیست B6 ،B18 ،B24 ، B17 ، B42 و B41بعنوان Pseudomonas fluorescens جدا شده از مزرعه آلوده به قارچ Rhizoctoniasolani و جدایه هاي F14 ،F19 ،F24 ، F32 و F35 جداسازي شده از مزرعه آلوده بهF.monilifrome بعنوان Bacillus cereus شناسایی شده اند. در این ﲢقیق سه گروه به
ترتیب بعنوان ﲨعیتA ، B و Cدر نظر گرفته شد.
استخراج DNA و شرایط PCR جهت اﳒام آزمایش RAPDو استخراج DNA جدایه ها بر اساس CTAB و به روش Ausube ﳘکاران - 1 - اﳒام شد. واکنش PCR حهت اﳒام آزمایش RAPD بر اساسروش Ortiz-Herrera و ﳘکاران - 3 - اﳒام شد. براي این منظوربا استفاده از دستگاه ترموسایکلر Biometra با حجم هنایی 25 میکرو لیﱰ شامل 2/5 میکرو لیﱰ بافر 10 - PCR برابر غلظت - ، 1/3 میکرو لیﱰ 50 - MgCL2 میلی مولار - ، 3/5 میکرو لیﱰ1 - dNTPs میلی مولار - ، 1/5 میکرو لیﱰ از هر یک از آغازگرها - 60 ng/μl - ، 0/2 میکرو لیﱰ آنزﱘ Taq پلیمراز 5 - واحد در میکرو لیﱰ - ، 2 میکرو لیﱰ - 20 ng - DNA و 12/5 میکرو لیﱰ آب مقطر دوبار تقطﲑ اﳒام شد.
سیکل گرمایی شامل 5 دقیقه 94Ċ و 37 سیکل شامل 1 دقیقه در 94Ċ، 1 دقیقه در 52Ċ و 1 دقیقه در 72Ċ و در هنایت 5 دقیقه در 72Ċ ﳒام شد. ژل آگارز به روش سامﱪوک و ﳘکاران - 4 - ﲥیه و پس از رنگ آمیزي ژل با اتیدیوم بروماید، زیر نور ماوراء بنفش 312 - نانومﱰ - DNA ژل مرئی شد و با استفاده از دستگاه ژل داک - GDS 8000, BioRad., California, USA - از ژل عکسﱪداري شد.ﲡزیه آماري داده ها با استفاده از نرم بعداز عکس برداري ژل شکلهاي بدست آمده افزار .Bio Rad ﲡزیه وﲢلیل شده، داده ها به صورت ماتریس صفر ویک وارد نرم افزار Excelشد. ازنرم افزار Nt Sys -Pc 2/02 براي گروه بندي جدایهها استفاده شد.گروه بندي جدایهها با استفاده از روش UPGMA وشاخص جاکارد اﳒام گرفت. .به آمک نرم افزار POPGENE - ver.1.31 - میزان تتوع ژنتیکی درون گونه اي و نسبت تنوع ژنتیکی توزیع شده در ﲨعیتها مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و ﲝث
از ﳎموع 50 آغازگر 10 بازي، 5 آغازگر به علت نشان دادن چند شکلی بیشﱰدر آزمایشات، مناسب تشخیص داده شد آزمایشات PCR-RAPD با 5 آغازگر براي 19 جدایه باآﱰیایی اﳒام گرفت تعداد قطعات تکثﲑ یافته از 8 قطعه در آغازگر P4 تا 18 قطعه در آغازگر P6 متغﲑ بود. متوسط قطعات تکثﲑ یافته به ازاي هر آغازگر برابر 13 قطعه است. طول قطعات تکثﲑ یافته در آغازگرهاي ﳐتلف بﲔ 2507000 جفت باز متغﲑ بود. سنگﲔترین قطعه را آغازگر P6 با طول 7000 جفت باز اﳚاد آرد. به طور آلی تعداد 67 نوار از ﳎموع آغازگرهاي مورد استفاده بدست آمد آه 64 نوار در بﲔ ﲨعیتهاي مورد مطالعه چند شکل و 3 نوار یک شکل حاصل شد.
لذا درصد قطعات چند شکل 95/5 درصد ﳏاسبه شد. بیشﱰین درصد چند شکلی مربوط به آغازگر P8, P4 وP9 برابر 100 و آمﱰین مربوط به P6 برابر با 88/88 می باشد. بیشﱰین شاخص تنوع ژنتیکی مربوط به ﲨعیت A با 0/2914 و آمﱰین آن مربوط به ﲨعیت B با 0/2208 می باشد. بیشﱰین درصد جایگاه چندشکلی مربوط به ﲨعیتهاي C وA و آمﱰین مربوط به ﲨعیت B به ترتیب با %72/5 و %60 می باشد جدول . - 1 - حداآثر فاصله ژنتیکی آه در واقع ﳘان تفاوت قابل توجیه بﲔ دو موجود با استفاده از تنوع آللی میباشد. بﲔ ﲨعیت C و A به میزان 0/3019 و حداقل آن بﲔ ﲨعیتهاي B و A به میزان 0/26 میباشد.
اعداد بالاي قطر ماتریس بیانگر ﳘانندي ژنتیکی و اعداد پایﲔ قطر بیانگر فاصله ژنتیکی بﲔ ﲨعیتهاست - شکل . - 1 دراین ﲢقیق تنوع ژنتیکی بر اساس ضریب Nei براي سه ﲨعیت B , A و C به ترتیب 0/28 , 0/22 و 0/29 برآورد شد.. این موضوع در مدیریت مبارزه با بیماري هاي پوسیدگی طوقه و ریشه و سوختگی غلاف برگ برنج حائز اﳘیت می باشد.. به نظر می رسد نشانگر RAPD مورد استفاده قرار گرفته در این ﲢقیق ابزار مناسﱯ جهت تفکیک درون گونه اي جدایه هاي آنتاگونیست P.fluorescens باشد. نتایج به دست آمده با کارهاي کومار و ﳘکاران - 2 - مطابقت دارد.
