بخشی از مقاله
چکیده
باکتری Thiobacillus نقش مهمی در چرخهی گوگرد، اصلاح خاکهای آهکی و افزایش قابلیت فراهمی برخی از عناصر دارد. هدف از این پژوهش شناسایی باکتریهای T. thioparus و T . novellus در خاکهای کشاورزی شهرستان کرمانشاه بود. از سه منطقه در عمق 0 تا 30 سانتی متر سه نمونه در سه تکرار برداشت شد. کشت باکتری با استفاده از محیط کشت پستگیت اصلاح شده انجام شد، سپس استخراج DNA با کیت Analytik Jena آلمان انجام و به روش واکنش زنجیرهای پلیمراز1 باکتریهای موردنظر شناسایی شدند. نتایج حاکی از وجود باکتری T. thioparus در مناطق مطالعاتی دو و سه و وجود باکتریدر منطقه مطالعاتی سه بود. اما منطقه یک فاقد هر دو گونه مورد بررسی بود.
مقدمه
میکروارگانیسمها به عنوان جزء زنده معمولاٌ کمتر از یک درصد حجم خاک را به خود اختصاص میدهند با این حال تعداد و تأثیر آنها بسیار زیاد است - اصغرزاده، . - 2006 باکتریها یکی از مهمترین اجزاء تشکیل دهنده میکروارگانیسمهای خاک هستند که قادر به بهبود رشد گیاهان از طریق تأمین مواد مغذی گیاهی، ترشح هورمونهای رشد گیاهی و اسیدهای آلی میباشد و سبب افزایش باروری خاک و حفظ سلامت محیط زیست میشوند
یکی از مؤثرترین باکتریها در چرخهی گوگرد Thiobacillus هستند. این باکتریها با اکسایش گوگرد در خاکهای آهکی و قلیایی میتوانند در کاهش pH، اصلاح خاک، تامین سولفات مورد نیاز گیاه، انحلال برخی از عناصر غذایی و افزایش قابلیت جذب آنها مؤثر واقع شوند - . - Shabani et al, 2011 اکسیداسیون گوگرد و تبدیل آن به سولفات به دلیل نقش گوگرد در تشکیل پروتئین، روغن و بسیاری از ویتامینها در گیاه اهمیت دارد
در ایران به دلیل وجود خاکهای آهکی - - Banaee et al, 2004 و pH بالا، عناصر غذایی - فسفر، آهن، روی، مس و منگنز - دارای حلالیت کمی بوده و جذب آنها توسط گیاهان مشکل است - ملکوتی و همایی، . - 1994 یک راه کار موثر برای بهبود تغذیه گیاهان استفاده از مواد اسیدی مانند اسید سولفوریک و گوگرد عنصری است. اینگونه pH خاک حداقل در مقیاس کوچک کاهش و قابلیت جذب عناصر غذایی افزایش مییابد
از آنجایی که بخش اعظم اکسیداسیون گوگرد توسط باکتریهای Thiobacillus انجام میگیرد وجود این باکتری و فراهم کردن شرایط بهتر برای رشد آنها به افزایش بازدهی اکسیداسیون و اصلاح خاکهای آهکی کمک میکند - . - Tabatabai, 1994 برای شناسایی این باکتری از روش واکنش زنجیرهای پلیمراز که روشی دقیق و قوی در تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم می باشد استفاده میشود. در این فرآیند که تقلیدی از همانندسازی DNA است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شدهی دو انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA در درون لوله آزمایش امکان پذیر شود
در پژوهشی اکسیداسیون تیوسولفات بوسیلهی Halothiobacillus , T. thioparus و T. neapolitanusجدا شده از صنعت پتروشیمی مورد بررسی قرار گرفت. ترکیبات کاهنده گوگرد ترکیبات بدبویی هستند که از صنایع مختلف تولید میشوند و T. thioparus توانایی اکسیداسیون این ترکیبات را دارد و بطور معمول از این باکتریها برای تصفیه زیستی این ترکیبات استفاده میکنند . - Valdebenito et al, 2011 - در این مطالعه دو نژاد اکسیدکننده تیوسولفات از یک صنعت پتروشیمی در پالایشگاه نفتی در شیلی به دست آمد که با استفاده از تجزیهی مولکولی بوسیلهی RT-PCR با استفاده از پرایمرهای Thiobacillus بررسی شد. آنها بر اساس توالی یابی 16rsDNA نتیجه گرفتند که یکی از سویههای جدا شده متعلق به Thiobacillus است.
در پژوهشی دیگر برای شناسایی و جدا کردن باکتریهای حل کنندهی سنگهای فسفات تیلمسی در خاکهای کشاورزی مختلف مشخص شد که باکتریهای T. thioparus ،T. ferrooxidans وتیوباسیلوس T. thiooxidans. میتوانند فسفر موجود در آپاتیت را به وسیله اسید سولفوریک حاصل از اکسید شدن گوگرد، حل کنند. نتایج بدست آمده از PCR نشان داد که این خاکها از لحاظ تیوباسیلوسها فقیر هستند و مقدار اسید تولید شده و سنگ فسفات حل شده با رشد این باکترها ارتباط مستقیم دارد . - Babana et al, 2010 - این پژوهش با توجه به اهمیت وجود باکتریهای تیوباسیلوس که نقش اصلاح کنندگی و افزایش باروری خاک به ویژه در خاکهای آهکی را دارند با هدف شناسایی باکتریهای T. thioparus و T. novellus در خاکهای کشاورزی شهرستان کرمانشاه انجام شد.
مواد و روشها منطقه مطالعاتی
این آزمایش در سال 1395 و در سه منطقه از خاکهای کشاورزی شهرستان کرمانشاه صورت گرفت. منطقه اول در44´ 34° عرض شمالی و 46° 98´ طول شرقی، منطقه دوم در 34° 50´ عرض شمالی و 47 ° 3´ طول شرقی، و منطقه سوم در مزرعه تحقیقاتی دانشگاه رازی کرمانشاه با 34° 19´ عرض شمالی و 47 ° 6´ طول شرقی بود. نمونهها در سه تکرار برداشت شد. در نهایت از نمونههای ترکیبی جهت آنالیزهای آزمایشگاهی و شناسایی باکتریها بهره گرفته شد. برخی از خصوصیات اولیه خاکهای مورد آزمایش در جدول 1 آورده شده است.
جدول -1 خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاکهای مورد مطالعه
پس از نمونهبرداری، نمونهها به آزمایشگاه منتقل شد و مقداری از آنها جهت کشت باکتری در یخچال نگهداری گردید. باقی نمونهها در هوای آزاد سایه خشک شد و از الک2 میلی متر برای انجام برخی آزمایشها عبور داده شد. مواد آلی با روش والکی- بلاک - Nelson and Sommers, 1996 - ، کربنات کلسیم به روش - Richards, 1954 - و بافت خاک به روش - Gee - and Bauder, 1986 اندازه گیری شد.
برای کشت باکتری از محیط کشت پستیگیت اصلاح شده، که یک محیط اختصاصی برای کشت باکتری Thiobacillus است استفاده شد. عناصر غذایی مورد نیاز برای تهیه محیط کشت شامل 5 گرم تیوسولفات سدیم، 3 گرم سولفات آمونیوم، 0/5 گرم سولفات منیزیم، 0/25 گرم کلرید کلسیم، 3 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 1 میلی لیتر سولفات آهن آبدار، 10 میلی لیتر عناصر کم مصرف و 10 میلی لیتر معرف برموتیمول بلو است. عناصر کم مصرف شامل 5 گرم EDTA بدون سدیم، 2/2 گرم سولفات روی آبدار، 0/5گرم کلرومنگنز، 0/16 گرم سولفات مس، 0/16 گرم کلرید کبالت، 0/11 گرم آمونیوم هپتا مولیبدات و 0/54 گرم کلرید کلسیم است. پس از تهیه محلول محیط کشت با استفاده از هیدروکسید پتاسیم دو نرمال pH محیط روی 7 تنظیم شد سپس 40 میلی لیتر از محلول داخل ارلن مایر توزیع شد و در نهایت به آن یک گرم خاک اضافه شده و به مدت سه هفته در تکان دهنده با دور 120 قرار داده شد.
پس از تغییر رنگ محیط کشت از سبز به زرد که نشان دهنده رشد باکتری است استخراج DNA نمونهها با استفاده از کیت Analytik Jena آلمان و در آزمایشگاه شرکت ایده سازان زیستی زاگرس واقع در مرکز رشد واحدهای فناوری دانشگاه رازی انجام شد. طبق دستورالعمل استخراج این کیت، مقدار یک میلی لیتر از محیط کشت برداشته و محلولهای تعیین شده در پروتکل را به آن اضافه کرده و در نهایت DNA استخراج شد. برای این پژوهش پرایمرهای مورد نظر از مقالات گرفته شد - جدول - 2 و پس از سنتز، PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام شد. محصول PCR به ژل آگارز منتقل و الکتروفورز گردید و توسط دستگاه ژل داک عکسبرداری صورت گرفت.
جدول -2 توالی پرایمر باکتریهای مورد مطالعه
نتایج و بحث
نتایج حاصل از PCR نشان داد گونه T. novellus با توجه به باندهای ایجاد شده - شکل - 1 در خاکهای منطقه دو و سه وجود دارد اما در خاک منطقه یک این باکتری یافت نمیشود.
شکل -1 الکتروفورز محصول PCR ژن rRNA برای گونه . T. novellus باند :1 منطقه یک، باند :2 منصقه دو و باند :3 منطقه سه بر روی ژل آگارز % 1
همچنین با توجه به محصول PCR ژن rRNA گونه - T. thioparus شکل - 2 مشخص گردید که فقط در خاک منطقه سه این گونه وجود دارد.
