بخشی از مقاله
چکیده
پروتئینهای WRKY یک خانواده بزرگ از عوامل رونویسی میباشند که تنشهای زیستی، غیر زیستی و در نتیجه تولید متابولیتهای ثانویه را کنترل میکنند. در شرایط تنش، این عوامل به عنوان تنظیم کنندههای مثبت و منفی رونویسی عمل میکنند. خشخاش یک گیاه علفی یکساله و دیپلوئید میباشد که به دلیل خواص دارویی و همچنین دیدگاه استراتژیک جهانی مهم میباشد. این گیاه دارای یک گروه مخصوص از آلکالوئیدها به نام بنزیلایزو کوئینولین آلکالوئیدها مانند مورفین، کدئین و پاپاورین که ارزش بالایی در داروسازی دارند، میباشد.
در این مطالعه، ابزارهای بیوانفورماتیکی و دادههای آزمایشگاهی برای شناسایی و جداسازی ژن محتمل عامل رونویسی WRKY که حاوی یک دمینC2H2 میباشد، تلفیق شدند. طول کامل cDNA مربوط به گیاه خشخاش با استفاده از سرهمسازی تعداد زیادی از قطعات EST موجود در کتابخانه EST خشخاش و تکنیک 3'RACE-PCR جداسازی شد. آغازگرهای اختصاصی بر اساس توالی توافقی حاصل از سرهمسازی ESTها، طراحی شدند، سپس PCR انجام شد. قطعه جداسازی و توالی یابی شده با شماره دسترسی KP203854 در پایگاه اطلاعاتی GeneBank ثبت گردید. این قطعه از یک چهارچوب قرائت باز که یک پروتئین مربوط به خانواده عوامل رونویسی WRKY را کد میکند، تشکیل شده است.
مقدمه
گرایش عمومی به استفاده از داروهای گیاهی و به طور کلی فراوردههای طبیعی در جهان به ویژه در سالهای اخیر رو به افزایش بوده است. خاصیت درمانی گیاهان دارویی به دلیل متابولیتهای ثانویه و مواد موثره موجود در آنها میباشد. کاربرد و فواید این ترکیبها، نیازمند شناخت آنهاست که متاسفانه اغلب این ترکیبها و ژنهای کد کننده بیوسنتز آنها ناشناخته مانده است. خشخاش با داشتن متابولیتهای ثانویه متنوع به عنوان یک گیاه دارویی ارزشمند بوده که حاوی 80 آلکالوئید مختلف میباشد
یکی از مهمترین عوامل تاثیر گذار بر تولید متابولیتهای ثانویه در گیاهان، عوامل رونویسی میباشند. این عوامل میتوانند بر بیان ژنهای مسیر و در نهایت بر جریان متابولیک اثر بگذارند. جالب توجه است بیان ژن عامل رونویسی اغلب محدود به بیان اهداف خود و در نهایت به تجمع متابولیت است . - Broun et al 2006 - نقش اصلی بازی شده توسط عوامل رونویسی در کنترل رشد و همچنین مسیرهای متابولیسم ثانویه در گیاهان، آنها را به اهداف مهم برای تحقیق در متابولیسم گیاهان تبدیل می سازد.
یکی از نتایج و استفادههای عملی از فاکتورهای رونویسی مهندسی ژنهای این فاکتورها به عنوان ابزاری ارزشمند جهت دستکاری گیاهان میباشد که البته موفقیت در این امرمستلزم شناخت دقیق این ژنها است، برای مثال پروتئینهای WRKY یک خانواده بزرگ از عوامل رونویسی میباشند که در تنظیم برنامههای فیزیولوژیک گوناگون، از جمله دفاع در برابر پاتوژنها، تنشهای محیطی، پیری، زخمها، توسعه کرک، جنینزایی و تولید متابولیسمهای ثانویه دخالت دارند
همانطور که گفته شد بهبود تولید متابولیتهای ثانویه در گیاهان توسط دستکاری عوامل رونویسی امکانپذیر میباشد و اولین مرحله برای دستیابی به این هدف شناسایی ژنهای عوامل رونویسی در گیاهان میباشد، بدین منظور در این تحقیق، یک عامل رونویسی متعلق به خانواده عوامل رونویسی WRKY از گیاه خشخاش شناسایی، جداسازی و توالییابی گردید.
خشخاش
خشخاش متعلق به خانواده شقایق یا خشخاش1، جنس پاپاور2 و خودگشن میباشد. خواص دارویی خشخاش از آلکالوئیدهای موجود در آن ناشی می شود. یکی از بزرگترین و متنوعترین این گروه از ترکیبات، آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین3 میباشد که شامل بیش از 2500 ترکیب شناخته شده هستند. در این میان میتوان به مورفین4 - قویترین آلکالوئید، مخدر و معرق - - Gesell et al 2009 - و کدئین5 - مسکن و ضد درد - ، پاپاورین6 - سست کننده ماهیچه و گشاد کننده رگها - ، نوسکاپین7 - ضدسرفه و ضد تومور - ، سنگوئینارین8 - نوعی آنتیبیوتیک - ، تبائین، نارکوتین و نارسئین اشاره کرد
عوامل رونویسی WRKY
دُمین WRKY یک ناحیه 60 اسیدآمینهای میباشد، که در میان اعضای این خانوده به شدت حفظ شده است. این دمین شامل توالی حفاظت شده WRKYGQK در انتهای آمین و به دنبال آن یکی از دو نوع ساختار انگشت روی غیر معمولی C2H2 وC2H-C در انتهای کربوکسیل میباشد. همه پروتئینهای WRKY شناخته شده را میتوان بر اساس تعداد دمین WRKY و ساختار انگشت روی به سه گروه - ، ، - تقسیم کرد. پروتئینهای گروه دارای دو دومین INT9 - و - ICT10 و پروتئینهای گروه دارای یک دمین هستند.
در کل، پروتئینهای گروههای و دارای ساختار انگشت روی از نوع - C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H - C2H2 هستند. در گروه ، ساختار انگشت روی از نوع - C-X7-C-X23-H-X1-C - C2H-C میباشد. پروتئینهای WRKY گروه II بر اساس توالی اولیه اسیدآمینه به پنج زیرگروه تقسیم میشوند IId ,IIc ,IIb ,IIa - و . - IIe عوامل رونویسی WRKY از اجزای مهم سیستم دفاعی گیاهان در بسیاری از جنبهها هستند. این عوامل همچنین در فرآیندهای توسعه و نمو بذر وگیاه نقش دارند . - Rushton et al 2010 - اولین عضو از خانواده عوامل رونویسی WRKY، 19 سال قبل شناسایی گردید. دو گزارش اول مربوط به پروتئینهای متصل شونده به DNA بوده که در تنظیم بیان ژن از طریق ساکارز - SPF1 - یا در طول جوانهزنی ABF1 - و - ABF2 نقش داشتند. طی سومین گزارش، سه پروتئین به نامهای WRKY1، WRKY2 و WRKY3 شناسایی گردیدند. این مقاله همچنین برای اولین بار نقش پروتئینهای WRKY در دفاع پاتوژنها را اثبات نمود
تکثیر سریع پایانههای - 3'RACE-PCR11 - cDNA
جهت تکثیر سریع پایانههای cDNA و به دست آوردن نسخههای ناشناخته مربوط به قطعات ژنی، از نوع تغییر یافتهای از RT-PCR به نامRACE-PCR12 استفاده شد. این روش یک دستورالعمل برای تکثیر نواحی cDNAمربوط به َ5و یا َmRNA 3 میباشد و با موفقیت زیادی برای جدا کردن نسخههای کمیاب استفاده شده است. در روش 3'RACE از یک آغازگر تغییر شکل یافته به نام Oligo - dT - استفاده میشود.
مواد و روشها
برای شناسایی ژن محتمل عامل رونویسی WRKY و طراحی پرایمر برای جداسازی این ژن، از توالیهای EST موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI استفاده شد. سپس این توالیها توسط برنامه Codon Code Aligner سرهمسازی شدند و یک توالی توافقی حاصل گردید. برای ترجمه توالی توافقی بهدست آمده به چهارچوب قرائت باز از برنامه آنلاینORF finder استفاده شد. به منظور شناسایی نوع و تعداد دمین WRKY، همردیفی چندگانه توسط برنامه ClustalW2 برای چهارچوب قرائت شده مورد نظر با توالی پروتئینی تعدادی WRKY مشابه که قبلا شناسایی شده بودند، انجام شد.
همردیفی به ما نشان میدهد که کدام ناحیه از توالیها، حفاظت شده و کدام ناحیه متغیر است و یک نمایش کیفی برای بیان تشابه بین دو توالی است. به منظور جداسازی ژن مورد نظر پنج آغازگر طراحی گردید - جدول . - 1 دو آغاز گر Forward و سه آغازگر .Reverse یکی از آغازگرهای Forward در ناحیه - FR.ORF - ORF و دیگری خارج از ناحیه - FR.1 - ORF طراحی گردید. برای Reverse هم یک آغازگر در ناحیه - RV.ORF - ORF و دو آغازگر در خارج از ناحیهRV.1 - ORF - بین RV.ORF و - RV.2 و RV.2 - خارجیترین - - RV. طراحی گردیدند. در واقع با طراحی آغازگرهایی در خارج از ناحیه ORF، علاوه بر جداسازی ناحیه کدکننده ژن WRKY، قطعاتی با طول بیشتر که علاوه بر ژن مورد نظر حاوی توالی-های بالادست و پایین دست ژن نیز میباشند، جداسازی گردیدند.
