بخشی از مقاله
تعیین تقلبات گیاهی زعفران با استفاده از مارکرهای مولکولی ITS
چکیده:
تولید محدود زعفران و قیمت بالای آن باعث شده است تا در این گیاه تقلبات زیادی صورت بگیرد، این تقلبات بیشتر شامل افزودن
موادگیاهی مشابه زعفران می باشد . برای تعیین این تقلبات روش های مختلف ی گسترش یافته است که بیشتر آن ها بر اساس مشخصات مورفولوژیکی، آناتومی و آزمون های شیمیایی است. این مطالعه نشان دهنده ی یک روش نوین برای تعیین تقلبات زعفران بر اساس روش های مولکولی می باشد که در آن از نشانگر مولکولی ( Internal transcribed spaer -2 )ITS- 2 استفاده شده است .در این بررسی از یک آغازگر عمومی بر مبنای ناحیه S rDNA َ/ِ و آغازگر های اختصاصی برگشتی بر مبنای ناحیه ی ITS- 2در گونه های مختلف تقلبات برای انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده گردید . بعد از انجام واکنش، باند مربوط به توالی ITS-2 در هفت گونه ی ذرت، گلرنگ، انار، فلفل قرمز و زردچوبه به عنوان تقلبات رایج زعفران، تکثیر شدند. لذا با استفاده از نتایج به دست آمده از این روش می توان برای تعیین تقلبات زعفران با حساسیت بالا استفاده کرد.
کلمات کلیدی:زعفران، تقلبات ، واکنش زنجیره ای پلیمراز ، توالی ITS- 2
مقدمه و بررسی منابع:
زعفران( ( Crocus sativus مرغوبترین و گرانترین ادویه جهان است که تولید محدود و قیمت بالای آن سبب شده تا دراین گیاه
تقلبات زیادی صورت بگیرد. تقلباتی که در زعفران به کار می رود معمولا شامل افزودن مواد گیاهی مشابه است که شناسایی آنها مشکل می باشد نظیر گل انار، ذرت، گلرنگ، ،زردچوبه، ریشه گندم وهمچنین ترکیبات ارگانیک مانند عسل و روغن و ترکیبات غیر ارگانیک نظیربرات ، سولفات وکلرید کربنات است . (2)
برای تعیین تقلبات زعفران روش های مختلفی گسترش یافته است که بیشتر آنها بر اساس مشخصات مورفولوژیکی ،آناتومیکی وآزمون های شیمیایی است عموما این روش ها برای آنالیزتعداد زیاد نمونه ها مناسب نیستند وارزیابی های ساختاری برای تعیین
تقلبات نیازمند نیروهای متخصص است ( . (3 همچنین منابع گیاهی تغییر پذیر هستند و پیچیدگی شیمیایی دارند . ا ما از آنجا که نشانگر های مبتنی بر DNA قابلیت بالایی برای شناسایی گونه ها داشته و تغییر پذیری آنها نسبت به روش های شیمیایی و فیزیکی
بسیار پایین است لذا استفاده از آ نها برای شناسایی تقلبات گیاهی می تواند مفید باشد. تعدادزیادی ازنشانگرهای مولکولی
مانندPCR-RFLP، AP-PCR ، ARMs، SCAR وRAPD اخیرا برای تایید خلوص گیاهان دارویی استفاده شده اند. اگرچه این روش ها برای شناسایی تاکسونومی و تشخیص داروهای گیاهی خام از جایگزین های آن و مواد تقلبی آن سودمند هستند ولی کاربرد آنها به خاطر شرایط مختلف آزمایش محدود شده است. به عنوان نمونه برای RAPD تکرار پذیری به شدت تحت تاثیر
کیفیت و غلظت DNAی الگو ، نسبتDNAی الگو به آغازگر ، افت و خیز های جزئی ترکیبات واکنش و پارامتر های چرخه ها
است. درPCR-RFLP طول محصولات PCR استفاده از آن را محدود می کند چون تعداد مکان های برشی در توالی بین دو
آغازگر محدود است .(4)
ثابت شده است که توالی ITS در DNAی ریبوزومی توالی تغییر پذیری است که برای مطالعات فیلوژنتیکی در بسیاری از خانواده های قارچ هاو یوکاریوت ها مناسب بوده است. شایستگی مارکر ITS برای مطالعات فیلوژنیک به خاطر دلایلی از جمله وراثت دو
والدی، فراگیری ، آسانی ، یکسانی داخل گونه ای ، تغییر پذیری بین گونه ای وتعداد کپی زیاد می باشد .(1) به عنوان مثال یانگ وی سون و همکاران ( ًًٌٍ) ، برای شناسایی هیبرید های سه گونه ارکیده P. armeniacum ، P. micranthum و P. delenatii از هم با استفاده از یک ناحیه کاملا محافظت شده در rDNA ITS این سه گونه یک آغازگر عمومی طراحی کردند که در همه ی گونه ها یک باند ًُّ جفت بازی ایجاد شد. این قطعه DNA از تمام این سه گونه استخراج شد، توالی یابی شد و توالی های شناسایی شده با همدیگر مقایسه شدندکه با توجه به مناطق مختص هر گونه ، برای هرگونه آغازگر اختصاصی تهیه گردید. علاوه
بر این برای بهبود کاربرد نشانگر های SCAR سه آغازگر اختصاصی ITS به طور همزمان در PCR چندگانه استفاده شدند و نتایج
تایید کرد که ترکیب این نشانگر ها باعث شناسایی هر گونه و نتاج هیبرید های انها از گونه های بسیار نزدیک می شود. لذا با توجه به
این نتایج و تحقیقات به نظر می رسد که استفاده از نشانگر مولکولی ITS برای تعیین تقلبات به کار رفته در صنعت زعفران سودمند باشد.
موادوروش ها:
تهیه مواد گیاهی و استخراج :DNA
چهار رقم از بذور ذرت به نام های SC704، SC260، SC400 و کنسول از مرکز تحقیقات کشاورزی خراسان رضوی واقع در
طرق تهیه شد .چهار رقم انار با نام های رباب پوست قرمز، سفید ربی ترش، ملس یزدی ومخمل پوست قرمز از محل گلخانه ی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد جمع آوری شد . چهار رقم گلرنگ به نام های محلی اصفهان(ٌٌَ) ، محلی مرند(ٌٍّ) ،-S )541ٌََ)، )Bacumq2ًَ) از نقاط مختلف جمع آوری شد و نمونه های خشک شامل کلاله ی زعفران ، کلاله گلرنگ ، کلاله ی انار ،کلاله ذرت ،فلفل قرمز وزردچوبه از مراکز مختلف خریداری شد . نمونه های تازه پس از وزن شدن جهت ذخیره در
فریزرًَ- در داخل میکروتیوب ِ/ٌ میلی لیتری نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از روش CTAB برای تمام نمونه های خشک وتازه انجام شد و تعیین کیفیت نمونه های استخراجی DNA با استفاده از الکتروفورزصورت گرفت .
طراحی آغزگر وانجام واکنش زنجیره ای پلیمراز:
در این مرحله از توالی 5.8S و توالی ITS-2 به ترتیب برای طراحی یک آغازگرعمومی رفتی برای تمام نمونه های تقلبات گیاهی و
طراحی هفت آغازگر اختصاصی برگشتی برای هریک از تقلبات استفاده شد. طراحی آغازگر ها با استفاده از نرم افراز Primer
Premier انجام شد. هر یک از گیاهان مورد نظربا استفاده ازآغازگر های خود به تنهایی در واکنش مجزا PCR شدند و دمای
واسرشته سازی آنها مورد بررسی قرار گرفت که یک دمای واسرشته سازی واحد ( َِ درجه سانتیگراد) برای شش گیاه ذرت، انار،
گلرنگ، زعفران، فلفل قرمزو زردچوبه مورد توافق قرار گرفت. بعد از انجام واکنش PCR برای مشاهده ی باند های مورد نظر از
الکتروفورز افقی با آگارز یک درصد استفاده شد که به میزان ّ میکرولیتر از DNA ی مورد نظر در داخل چاهک ها بارگذاری شد.
برلی تهیه مواد PCR از کیت EmeraldAmp GT PCR Master mix استفاده شد.
نتیجه گیری و بحث:
در این مطالعه با استفاده از توالی ریبوزومی ITS-2 آغازگرهایی طراحی شدند که ناحیه 5.8S rDNA و ITS-2 را در هفت گونه
ی انار، گلرنگ، ذرت، فلفل قرمزو زردچوبه تکثیر کنند.آغازگر رفت طراحی شده از مناطق مشابه در هر هفت گونه (منطقه ی Sَ؟ِ) و برای تمامی گونه ها یکسان بود و آغازگر برگشتی از مناطق مختص هر گونه (بر اساس ( ITS- 2 تهیه شد. بعد از انجام واکنش
زنجیره ای پلیمراز توالی ITS -2 در هر هفت گونه تکثیر شد و یک باند منحصر به فرد برای هر کدام ازگونه ها با استفاده از توالی آغازگرهای ITS -2 تکثیر شد و باند های حاصله بین ًٍِ تا ًَِجفت باز طول داشتند (شکل ٌ) که در ادامه یک واکنشPCRچندگانه برای تمامی گونه ها انجام شد.سپس امکان تکثیر تمامی باند ها در یک واکنش PCRچندتایی مورد بررسی قرار
گرفت که نتایج حاکی از تکثیر موفقیت آمیز باند ها در یک واکنش PCRبود منتها به علت نزدیکی اندازه باندها سه باند متمایز و پررنگ برای ّ گونه تکثیر شدند (شکلٍ) که در ادامه کار از ژل پلی آکریل آمید برای تفکیک این باندها استفاده خواهد شد. .بنابراین
نتایج نشان دهنده ی پراکندگی قابل توجه بین این گونه ها می باشد و با استفاده از مارکر ITS-2 می توان زعفران را از گونه هایی که ممکن است به عنوان تقلب مخلوط با آن استفاده شوند شناسایی کرد.
