بخشی از مقاله
چکیده
کلروپلاست یک اندامک حیاتی در سلولهاي گیاهی و جلبکهایی است که فتوسنتز میکنند و منبع اولیه غذاي جهان محسوب می-شوند. بیان ژنهاي خارجی در کلروپلاست داراي مزایاي متعددي نسبت به بیان آنها در هسته است: بیان زیاد، توانایی ایجاد اپران و فقدان تغییرات اپیژنتیکی در کلروپلاست، از جمله این مزایا میباشند. به علاوه، کلروپلاستها به دلیل داشتن توارث سیتوپلاسمی، توسط دانه گرده منتقل نمیشوند.
درسالهاي اخیر، پیشرفت چشمگیري در مهندسی کلروپلاست حاصل شده است. بیشتر روشهاي انتقال ژن به کلروپلاستها، برمبناي نوترکیبی همولوگ طراحی شدهاند. در این پژوهش، روشهاي مورد استفاده در ترانسفورماسیون سلولهاي گیاهی، وکتورهاي مورد استفاده، اجزا موجود در این وکتورها و به طور ویژه مارکرهاي انتخابی مورد استفاده در مهندسی کلروپلاست، مورد بررسی قرار گرفته است.
.1 مقدمه
کلروپلاستها اعضا کلاس ارگانلی پلاستیدها میباشند و در سلولهاي گیاهی و جلبکها یافت میشوند. کلروپلاستها به عنوان جایگاههاي فتوسنتز، اولین منابع تولید کنندهي غذا به شمار میروند و علت اصلی بقا گیاه میباشند. از دیگر فعالیتهاي بسیار مهم پلاستیدها، میتوان به تولید اکسیژن، تثبیت کربن، تولید نشاسته، سنتز اسیدآمینه، سنتز اسیدهاي چرب، تولید رنگدانه و متابولیسم نیتروژن و سولفور اشاره کرد. کلروپلاستها اندامکهایی هستند که از اجداد سیانوباکتریایی منشا گرفتهاند.
عنوان شده است که اجداد سیانوباکتریایی توسط یک سلول یوکاریوت اولیه به دام افتاده و با آن همزیست شدهاند. با این که ژنوم کلروپلاست در مقایسه با سیانوباکتري آزاد اولیه کوچکتر است، اما توالی ژنومی باقیمانده بسیار مشابه توالی ژنومی این موجود است. ژنوم کلروپلاستی گیاهان خشکی به طور معمول حاوي 120- 110 ژن منفرد است. در حالی که ژنوم سیانوباکتريها حاوي بیش از 1500 ژن میباشد. بسیاري از این ژنهاي کاهش یافته کلروپلاستی در ژنوم هستهاي میزبان حضور دارند . - Verma D and Daniell H 2007 -
.1,1 ژنوم کلروپلاست
ژنوم کلروپلاست عموماً یک DNA دو رشته با طول 220- 120 کیلوباز است که ptDNA نیز نامیده میشود. ژنوم پلاستید در گیاهان عالی، به صورت پلیپلوئید است. به این معنا که در هر کلروپلاست، تعداد زیادي کپی ژنومی وجود دارد. تعداد کلروپلاستها و تعداد کپیهاي ژنومی از یک گونه به گونهي دیگر متفاوت است. براي مثال، هر سلول برگ گیاه آرابیدوپسیس حدوداً حاوي 120 کلروپلاست و ptDNA 17000-1000 میباشد. در حالی که در هر سلول برگ تنباکو حدود 100کلروپلاست وجود دارد که جمعاً 10000 کپی ptDNA دارند . - Lutz KA, Azhagiri AK et al. 2007 - ژنوم کلروپلاست سازمان یافتگی بسیار حفاظت شدهاي دارد.
ژنوم کلروپلاستی اغلب گیاهان خشکی، دو کپی یکسان از توالیهاي تکراري معکوسIRA - 1 و - IRB دارد که بین آنها یک ناحیهي تک نسخه بلند - LSC - 1 و یک ناحیه تک نسخهي کوتاه - SSC - 2 قرار گرفته است . - Verma D and Daniell H 2007 - تصویر شماتیک ژنوم کلروپلاست در شکل 1 نشان داده شده است. در این تصویر، اندازهي نواحی IR، LSC، SSC و تعداد ژنهاي موجود در ژنوم کلروپلاست برخی از گیاهان نیز نشان داده شده است. شکل .1 تصویري شماتیک از سازمان یافتگی ژنوم کلروپلاست. در شکل، اندازهي نواحی مختلف ژنومی و تعداد ژنهاي موجود در ژنوم کلروپلاست گیاه آرابیدوپسیس، اسفناج و ذرت نیز نشان داده شده است . - Primrose SB and Twyman RM 2006 -
.2,1 ترانسفورماسیون کلروپلاست
ترانسفورماسیون پلاستها اغلب توسط روش ریز بمباران3 و یا تیمار پروتوپلاست توسط پلی اتیلن گلایکول - PEG - 4 انجام میشود و طی آن وکتور حاوي ژن مورد نظر به درون کلروپلاست انتقال مییابد. ژن منتقل شده سپس به روش نوترکیبی همولوگ و از طریق سیستم RecA-type وارد ژنوم کلروپلاست میگردد . - Sarwar Khan M, Kanwal B et al. 2015 - بنابراین وکتورهاي ترانسفورماسیون کلروپلاست حاوي توالیهاي مربوط به نوترکیبی در دو طرف کاست ترانسفورماسیون هستند. این توالیها حدود 1Kb طول دارند. هر دو توالی براي وقوع نوترکیبی همولوگ ضروري میباشند. ترانسفورماسیون کلروپلاست از چندین نظر داراي اهمیت میباشد : - Verma D and Daniell H 2007 -
-1 پروتئینهاي دارویی تولید شده در گیاه، فاقد آلودگی توسط وکتورهاي ویروسی پستانداران و انسان میباشند.
-2 در بسیاري از گونههاي گیاهی، ژنهاي پلاستیدي الگوي توارث مادري دارند و لذا ژنهاي انتقال یافته به پلاستها، توسط دانهي گرده انتقال پیدا نمیکنند - مردان عقیم سیتوپلاسمی هستند - . این امر سبب میگردد تا انتقال ژنها به کلروپلاست-ها ابزار ارزشمندي جهت تولید و پرورش گیاهان دستورزي شده باشد.
-3 مزیت دیگر ترانسفورماسیون کلروپلاستها، توانایی آنها در تولید مقادیر زیاد پروتئین خارجی است 46 - درصد کل پروتئین برگ - . این امر به دلیل پلیپلوئید بودن سیستم ژنتیکی پلاستیدها میباشد. به علاوه با وجود آن که سطح رونویسی ژن خارجی 169 برابر بیشتر از ترانسفورماسیون هستهاي به وقوع میپیوندد، خاموشی روي نمیدهد.
-4 تلقیح اختصاصی قطعهي ژنی مورد نظر به ژنوم کلروپلاست توسط توالیهاي DNA اختصاصی و انجام نوترکیبی همولوگ، نگرانی وقوع اثر مکانی5 را که اغلب در ردههاي ترانس ژن هستهاي دیده میشود را برطرف میسازد.
-5 مزیت دیگر ترانسفورماسیون کلروپلاستی، امکان تولید چندین پروتئین از یک mRNAي پلی سیسترونیک است و این امر به تولید واکسنهاي چندزیرواحدي در یک مرحله از ترانسفورماسیون کمک فراوانی مینماید.
-6 پروتئینهاي خارجی تولید شونده در کلروپلاست، داراي تاخوردگی مناسب و تغییرات پس از ترجمهاي مانند پیوندهاي ديسولفیدي میباشند. تاکنون ترانسفورماسیون کلروپلاست بیشترین موفقیت را در مورد تنباکو داشته است، هرچند این نوع ترانسفورماسیون در مورد محصولات باارزش دیگر نظیر دانهي سویا و پنبه نیز با موفقیت انجام شده است . - Verma D and Daniell H 2007 -
.1,2,1 اجزاء موجود در وکتورهاي کلروپلاستی
وکتورهاي انتقال ژن به کلروپلاست، عموماً داراي توالیهاي flank و کاست بیانی کلروپلاست هستند - شکل - 2 که در ادمه خصوصیات هر کدام از این نواحی مورد بررسی قرار میگیرد . - Verma D and Daniell H 2007 - شکل .2 اجزاء معمول موجود در وکتورهاي کلروپلاستی.وکتورهاي کلروپلاستی عموماً داراي توالیهاي flank و کاست بیانی میباشند. کاست بیانی خود داراي پروموتر، مارکر انتخابی، توالیهاي تنظیمی و جایگاه ورود ژن خارجی است . - Verma D and Daniell H 2007 -
.2,2,1 توالیهاي flank در وکتورهاي کلروپلاستی
توالیهاي flank توالیهایی هستند که در آنها نوترکیبی همولوگ رخ داده و کاست بیانی وارد ژنوم میشود. کاست بیان را در چندین ناحیه از ژنوم کلروپلاست میتوان وارد نمود. تاکنون بیش از 14 جایگاه دخول کاست بیانی در گیاه تنباکو مورد بررسی قرار گرفتهاند. اما از میان این 14 ناحیه، 3 ناحیه کارایی انتقال بالایی دارند که عبارتند از: trnI/trnA، trnV/3´rps12 و .trnfM/trnG توالیهاي trnI/trnA و trnV/3´rps12، درون نواحی IR زنوم کلروپلاست قرار گرفتهاند، در حالی که توالی trnfM/trnG در ناحیهي LSC ژنوم کلروپلاست تنباکو قرار دارد. بررسیها نشان داده است که ورود یک کپی ژنی به ناحیه IR، سبب ورود سریع کپی دوم به IR دیگر میشود . - Bock R 2007 - وکتورهاي حاوي ژنهاي trnI/trnA، اولین بار در سال 1998 توسط Daniel و همکارانش مورد استفاده قرار گرفتند. دو ژن trnI/trnA، کد کنندهي tRNA میباشند و درون اپرون rrn قرار گرفتهاند. اپرون rrn، رونویسی از 16srRNA و 23srRNA را کنترل مینماید.
