بخشی از مقاله
چکیده
سندرم داون یکی از مهمﱰین علل عقب ماندگی هاي ذهﲏ و جسمی است که در اثر عدم تفرق صحیح کروموزوم 21 اتفاق می افتد. در این مطالعه براي اولﲔ بار در ایران منشأ والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي کروموزوم 21 در 260 خانواده داراي فرزند مبتلا به سندرم داون با روش سیتوژنتیک و بررسی مولکوﱄ DNA صورت پذیرفت. ابتدا با روش سیتوژنتیک ، تریزومی آزاد کروموزوم 21 در 238 بیمار مشخص گردیدو سپس با روش مولکوﱄ و استفاده از پنج مارکر STR اختصاصی کروموزوم 21 شامل D21S11, D21S1414, D21S1440, D21S1411, D21S1412 منشأ والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي در 226 بیمار با موفقیت به اﳒام رسید. از ﳎموع 226 بیمار، تریزومی آزاد با منشأ مادري در - %88 - 198 و با منشأ پدري در - %12 - 28 بیمار مشاهده شد. مرحله اشتباه میوزي در بیماران با منشأ مادري به ترتیب 140 مورد - %62 - در میوزI و 58 مورد - %26 - در میوز II مشاهده شد. این مقادیر در بیماران با منشأ پدري به ترتیب برابر با - %8 - 20 و - %4 - 8 بیمار بوده
است و بر اساس بررسی هاي آماري ارتباط معﲏ داري بﲔ سن مادري مادران سندرم داون با منشأ مادري و مرحله اشتباه میوزيI و II مشاهده نگردید - . - P=0/343
لغات کلیدي: سندرم داون، STR، تریزومی، پلی مورفیسم، عدم تفرق صحیح.
مقدمه
باعث سندرم داون یکی ازمعمولﱰین آناپلوئیدي هاي کروموزومی است که عقب ماندگی هاي ذهﲏ و جسمی و ضایعاتی مانند ناهنجاري هاي قلﱯ، افزایش شانس ابتلا به سرطان و آلزاﳝرهاي زودرس میگردد . - 2 - علت اولیه سندرم داون ، عدم تفرق صحیح کروموزوم 21 در تقسیم میوز است که بیشﱰ با منشأ مادري در مرحله میوز I در موقع تشکیل گامت ها اتفاق می افتد. در بیماران سندرم داونی که کروموزوم 21 آهنا منشاء پدري دارد، اشتباه میوزي در مرحلهء تولید اسپرم در مردان اتفاق می افتد، که فراوانی آن در ﲨعیت هاي ﳐتلف %12-5 گزارش شده است . - 14 - ﳘچنﲔ عدم تفرق صحیح کروموزومی در تقسیم میتوز سلوﳍاي سوماتیک با فراوانی حدود %5 در مرحله بعد از تشکیل سلول ﲣم مشاهده می شود 3 - ،. - 2
روش هاي معمول کاریوتایپینگ در تشخیص سندرم داون، تریزومی هاي آزاد مربوط به این سندرم را مشخص می کند بدون آنکه منشاء والدیﲏ آن را به درسﱵ تعیﲔ کند. علی رغم پیشرفت هاي زیادي که در ﲢقیقات اﳒام شده، علت سندروم داون هنوز به درسﱵ معلوم نیست و تنها وجود ارتباط بﲔ افزایش سن مادري و افزایش فراوانی سندرم داون به اثبات رسیده است 14 - ،. - 2 اما ﳘچنان این سوال باقی مانده است که تریزومی 21 با منشاء پدري است یا مادري و یا درمیوز I یا II اتفاق می افتد، آیا از ﳊاظ ژنتیکی دلایل مشابه یا متفاوتی وجود دارد که باعث عدم تفرق صحیح کروموزوم 21 می شود 14 - ،3،. - 2 براي اینکه بتوانیم به طور قاطع به این سوال پاسخ دهیم می بایست عامل سندرم داون را در ﲨعیت هاي ﳐتلف از نظر منشاء والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي مشخص کنیم تا اینکه قادر باشیم ریسک فاکتور هاي ژنتیکی یا ﳏیطی آن را در این سندرم نشاندهیم. براي مثال، مطالعه ریسک فاکتورهاي ژنتیک مادري در سندرم داون اگربدون تعیﲔ منشاء والدیﲏ صورت پذیرد می تواند منجر به یک ارتباط غﲑمعﲏ داري شود چون مادرانی که منشاء تریزومی 21 در فرزندانشان نبودند نیز در مطالعه ما وجود دارند.
یکی از مزایاي استفاده از تکنولوژي هاي STR این است که به ما اجازه می دهد که در خانواده هائی که فرزند سندرم داون دارند بتوانیم منشاء والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي اناپلوئیدي کروموزوم 21 را مشخص کنیم - 1، 5، 6، 10، . - 11 مارکرهاي STR که روي بازوي بلند کروموزوم 21 قرار دارند جهت تعیﲔ منشاء والدیﲏ و اشتباه میوزي در بعضی از ﲨعیت ها بکار رفته اند. STR هاي پلی مورفیک مربوط به کروموزوم 21 در بیشﱰ بیماران بصورت سه الل ﳎزا ظاهر شده که نسبت هاي 1:1:1 با ﳘدیگر دارند. اگر این الل ها بصورت دو تائی باشند، نسبت 2:1 را نشان می دهند. ما با استفاده از کمیت ﳏصولات PCR این STR ها می توانیم مشخص کنیم که هر کروموزوم 21 بیمار از چه والدي به ارث رسیده ات 6 - ، 10 ،. - 11
مواد و روشها
این مطالعه بر روي تقریباً 600 ﳕونه متعلق به 260 خانوادهء داراي فرزند سندرم داون آه از طرف مراآز نگهداري عقب مانده هاي ذهﲏ جهت شرآت در این پروژه، دعوت شده بودند، صورت گرفت.
از بیماران و والدینشان در فالکون هاي 15 میلی مﱰي، 5 میلی لیﱰ خون گرفته شد. سپس خون هر ﳕونه به درون دو میکروتیوب که یکی حاوي آنﱵ کواگولانت Na-Heparin جهت استفاده در بررسی هاي سیتولوژیک و دیگري حاوي آنﱵ کواگولانت EDTA براي استفاده در بررسی هاي PCR بود، منتقل شد کاریوتیپ براي زیرگروهی که قبلاً کاریوتیپ نشده بودند، توسط تست هاي سیتوژنتیکی معمول براي عدم تفرق صحیح کروموزوم 21، موزائیسیسم ناشی از عدم تفرق صحیح سلول سوماتیکی و ترانس لوکاسیون کروموزوم 21 صورت گرفت. براي بررسی DNA ازﳕونه هاي خون ﲨع آوري شده، از روش معمول استخراج DNA بوسیله فنل-کلروفورم استفاده شد . - 9 - تکثﲑ بوسیله PCR با استفاده از تواﱄ هاي پراﳝر 5 مارکر STR اختصاصی کروموزوم D21S11, 21
D21S1414, D21S1440 - - D21S1411, D21S1412 صورت گرفت.
دو تواﱄ مارکر از Pertl et al., 1996، و باقی تواﱄ ها از بانک اطلاعات ژنوم - http://www.gdb.org/ - گرفته شد. این مارکرها پلی مورفیک هستند و اخﲑاً براي تشخیص سندرم داون و تعیﲔ منشاء والدیﲏ در دیگر ﲨعیت ها استفاده شده اند 13 - ،11،10،8،7،. - 4 بررسی پلی مورفیسم با استفاده از ژل پلی اکریلامید جهت جدا سازي ﲠﱰ الل هاي متفاوت صورت گرفت. ژل ها با روش رنگ آمیزي معمول نیتزات نقره رنگ آمیزي و الل ها رویت شدند. Pharmacia LKB - Ultrascan XL - biotechnology به عنوان وسیله تراکم سنج جهت اندازه گﲑي تراکم باند هاي ﳏصول PCR استفاده شد. الکﱰوفوتوگرام ﳏصولات براي ﳕونه هاي تریزومی صورت گرفت. رابطه بﲔ سن مادر و مرحله اشتباه میوزي توسط Student T- test با استفاده از نرم افزار آماري - Chicago , Ilinois - SPSS-12 تعیﲔ شد.
نتایج و ﲝث
ﲤامی بیماران مورد بررسی هاي سیتوژنتیکی و مولکوﱄ قرار گرفتند. در آزمایش سیتوژنتیک اشتباه میتوزي کروموزوم 21 در 22 مورد مشاهده شد که از آهنا 13 مورد موزائیک و 9 مورد ترانس لوکاسیون کروموزوم 21 را شامل می شد.در این مطالعه منشاء والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي پدیده عدم تفرق صحیح را آه در اتیولوژي سندرم داون اﳘیت دارد را بررسی آردﱘ. در بررسی آروموزومی ﲤام بیماران سندرم داون، پدیده عدم تفرق صحیح میوزي در 238 مورد - %91.5 - ، تریزومی موزائیک در 13 مورد - %5 - و ترانس لوآاسیون در 9 مورد - %3/5 - از بیماران مشاهده شد. از 238 بیمار 12 مورد در آزمایش مولکوﱄ مونومورفیک بودند، و در 226 مورد منشاء والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي مشخص شد. عدم تفرق صحیح آروموزوم مادري در %62 - %88 در میوز I و %26 در میوز - II و عدم تفرق صحیح آروموزوم پدري در %8 - %12 در میوز I و %4 در میوز - II بیماران مشاهده شد.
نتایج بدست آمده از مطالعه 238 بیمار نشان داد آه روش مولکوﱄ روشی قابل اعتماد در تشخیص تریزومی آروموزوم 21 سندرم داون، با استفاده از مارآرهاي پﱄ مورفیک STR می باشد. ﳘچنﲔ منشاء والدیﲏ و مرحله اشتباه میوزي را می توان با این روش مشخص ﳕود. این روش حﱵ می تواند به خوبی تریزومی هاي دو اللی را از گروه نرمال مشخص ﳕاید. در آزمایش PCR-STR هنگامی آه بیش از یک مارآر بکار رود، ﲠﱰ است و افزایش تعداد مارآرها احتمال ﳘوزیگوسیﱵ را آاهش داده و چند اللی بیشﱰي مشاهده می شودد. در مطالعهء ما تکثﲑ غﲑ طبیعی ﳏصول PCR مشاهده نشد. مارآرهاي انتخاب شده در این مطالعه در ﲨعیت هاي انسانی در دسته مارآرهاي خیلی متنوع بوده و بطور مناسﱯ حﱵ در ناحیه ﲝرانی سندرم داون - DSCR - در آروموزوم 21 قرار دارد آه ترانس لوآاسﲔ هاي آوچک و تریزومی هاي جزئی آروموزوم 21 را نیز می توان با استفاده از آن ها تشخیص داد. بر طبق آنالیز هاي آماري بﲔ عدم تفرق صحیح کروموزوم مادري میوز I و II و سن مادر ارتباط معﲏ داري را با افزایش ریسک سندروم داون نشان ﳕی دهد - - تشکر و قدردانی ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوري و ﲪایت ماﱄ این ﲢقیق در پژوهشگاه این واحد صورت گرفت. بدین وسیله از خاﱎ ها فائزه جهان شاد، شهلا ﳏمد گنجی، ﲰیه رئوف زاده و آقاي ﳏمد غضنفري و ﲤامی کسانی که در اﳒام این پروژه ما را یاري کردند، تشکر و قدردانی می کنیم.
