بخشی از مقاله
چکیده
ارقام گلابی داراي خودناسازگاري گامتوفیتی - GSI - هستند که توسط یک لوکوس چند آللی کنترل میشود. بنابراین تعیین خود و دگر - نا - سازگاري ارقام براي انتخاب ارقام گردهزا و تولید میوه و موفقیت در برنامه هاي دورگگیري، ضروري است. هدف از انجام این پژوهش تعیین خود و دگر - نا - سازگاري یازده رقم گلابی شامل نه رقم گلابی آسیایی - Pyrus serotine Rehd. - و دو رقم گلابی بومی ایران - P. communis L. - بود. در این مطالعه از روش هاي خود و دگرگرده افشانی کنترل شده و به دنبال آن بررسی رشد لوله ي گرده در طول خامه با میکروسکوپ فلئورسنس استفاده شد.
همچنین ژنهاي S-RNase با استفاده از پرایمرهاي ‘FTQQYQ’ و ‘anti-IIWPNV’ تکثیر شدند و محصولات PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز - AGE - و ژل پلی اکریل آمید - PAGE - جدا شدند. خودگرده افشانیها و تلاقیها، خود و دگرسازگار در نظر گرفته شدند زمانی که حداقل یک لولهي گرده به بخش پایینی خامه در 25-30 درصد از مادگیها رسیده باشد. نتایج حاصل از میکروسکوپ فلئورسنس نشان داد که در بین ارقام مورد بررسی رقمهاي ‘KS8’ و ‘KS13’ خودسازگار و نه رقم دیگر خودناسازگار بودند.
تلاقی هاي KS6♀ × KS13♂ و KS13♀ × KS12♂ ناسازگار بودند. قطعات S-RNase از ژنوم تمام ارقام به جز رقم ‘Shahmiveh’ تکثیر شدند. تک باندهاي مشاهده شده در ‘KS8’ و ‘KS12’ در AGE به دو باند مجزا در PAGE جدا شدند. بنابراین، روش میکروسکوپ فلئورسنس و تکنیک PCR به عنوان روشهاي مناسب و قابل اتکا براي تعیین خود و دگر - نا - سازگاري ارقام گلابی و همچنین سایر اعضاي خانواده گلسرخیانمیتوانند مورد استفاده قرار گیرند.
مقدمه
میوهدهی در گلابی و بسیاري دیگر از اعضاي خانواده گلسرخیان نظیر سیب، بادام، آلو، زردآلو و گیلاس متأثر از چندین فاکتور ژنتیکی و محیطی - Gu et al., 2009 - به ویژه خودناسازگاري - Crane & lewis, 1942 - است. خودناسازگاري در گلابی همانند دیگر اعضاي خانواده گل سرخیان - Rosaceae - از نوع گامتوفیتیک بوده و در آن رشد لوله گرده حامل آلل-S در خامه ي گیاه دیپلوئید دارنده آلل-S مشابه، ممانعت میشود .
- De Nettancourt, 2001: Zisovich et al., 2004 - بنابراین خودناسازگاري یک راهبرد تکاملی در گیاهان گلدار است که از خویش آمیزي جلوگیري کرده و منجر به افزایش دگرآمیزي میشود - De .Nettancourt, 1997 - محل توقف رشد لولهي گرده به وسیله ي تجمع بالاي کالوز - β-1,3-glucan - در نوك لولهي گرده مشخص میشود . - De nettancourt, 1997 - بنابراین براي افزایش تولید میوه و کشت ارقام سازگار به هنگام احداث باغ هاي جدید و همچنین انجام تلاقیهاي مناسب در برنامههاي بهنژادي، شناسایی ارقام خودناسازگار و دگر ناسازگار ضروري است.
مواد و روشها
براي مطالعه ي خود و دگر - نا - سازگاري و انجام گردهافشانیهاي کنترل شده، از 11 رقم گلابی، 9 رقم گلابی آسیایی - Pyrus serotina Rehd - ، ‘KS6’، ‘KS7’، ‘KS8’، ‘KS9’، ‘KS10’، ‘KS11’، ‘KS12’، ‘KS13’، ‘KS14’ و دو رقم گلابی بومی ایران، ‘Shahmiveh’ و ‘Sebri’ کشت شده در باغ تحقیقاتی گلابی آسیایی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران، استفاده شد. خودگردهافشانی و دگرگردهافشانی کنترل شده به ترتیب براي 11 رقم مورد بررسی و سه رقم ‘KS6’، ‘KS12’ و ‘KS13’ در تمامی تلاقیهاي ممکن با روش اخته کردن گلها انجام شد.
جهت بررسی رشد لولهي گرده در طول خامه، از هر تیمار گرده-افشانی در روزهاي مختلف 48 - ، 72، 96 و 120 ساعت پس از گردهافشانی - تعداد 10 عددگل برداشت شده و به مدت 24 ساعت در محلول FAA - فرمالدئید %40، استیک اسید گلاسیال و اتانول %70 به نسبت - 18:1:1 تثبیت شدند. براي رنگ آمیزي لولهي گرده به منظور بررسی با میکروسکوپ فلئورسنس، گلهاي تثبیت شده، جهت نرم شدن به مدت 24 ساعت در 8 NaOH نرمال در دماي اتاق قرار گرفتند. سپس نمونهها به مدت 2 ساعت در محلول آنیلین بلو 0/1 درصد در فسفات بافر 0/1 مولار با pH=11 رنگ آمیزي شدند.
نمونهها پس از رنگ آمیزي، بین لام و لامل قرار گرفته به آرامی اسکواش شده و با میکروسکوپ فلئورسنس مدل Olympus Bx51 مورد بررسی قرار گرفتند. DNA ژنومی از برگهاي جوان به روش CTAB با کمی تغییرات استخراج شد. کیفیت و کمیت نمونه هاي DNA با استفاده از دستگاه نانودراپ و همچنین الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. PCR براي شناسایی آلل هاي S-RNase با استفاده از پرایمر هاي ‘FTQQYQ’ - 5’-TTTACGCAGCAATATCAG-3’ - و ‘anti-IIWPNV’ - 5’- AC - A/G - TTCGGCCAAATAATT-3’ - انجام شد. محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز % 1/5 و ژل پلی اکریل آمید %6 الکتروفورز شدند.
نتایج
نتایج استفاده از میکروسکوپ فلئورسنس نشان داد که در تمامی ترکیبهاي تیماري مورد بررسی، تندش دانه گرده در سطح کلاله به گونه ي مطلوبی صورت گرفته است. این پدیده بیانگر آن است که در هیچ یک از ارقام مورد بررسی مشکل تندش دانه گرده وجود نداشت. کلالهها نیز در تمامی ارقام سالم و پذیرا بودند - شکل . - 1 معمولا وجود حداقل یک لوله ي گرده درون تخمدان در اکثر مادگیهاي مورد بررسی یک رقم به عنوان تلاقی سازگار در نظر گرفته می شود.
در این مطالعه نیز بر اساس Lopez et al., - 2001 - ارقام سازگار در نظر گرفته شدند اگر لولههاي گرده در 25-30 درصد مادگیها به تخمک رسیده باشند. نتایج مطالعه میکروسکوپی رشد لوله گرده درون خامه در جدول 1 ارائه شده است. در تیمارهاي خودگرده افشانی 11 رقم مورد مطالعه، تعداد مادگیهایی که در آنها حداقل یک لولهي گرده 120 ساعت پس از گردهافشانی به انتهاي خامه رسیده بود از 28 درصد در رقم ‘KS13’ تا 37/5 درصد در رقم ‘KS8’ متغییر بود.
بنابراین این دو رقم به عنوان ارقام خودسازگار در نظر گرفته شدند - جدول . - 1 در سایر ارقام حتی 120 ساعت پس از گردهافشانی نیز هیچ لولهي گرده اي به انتهاي خامه نرسید و همگی محققین زیادي از روش هاي مختلف نظیر گردهافشانیهاي کنترل شده و به دنبال آن محاسبهي درصد تشکیل میوه و بررسی رشد لولهي گرده در طول خامه به وسیلهي میکروسکوپ فلئورسنس براي بررسی خودناسازگاري استفاده کرده اند - Kaufmane & Rumpumen, 2002 - امروزه با استفاده از روشهاي مولکولی و بیوشیمیایی نظیر روشهاي مبتنی بر PCR و تجزیهي گلیکوپروتئینهاي خامه - S-RNase - می توان با دقت بالایی نوع آللهاي-S ارقام مختلف را تعیین کرد - Mato et al., 2007; .Sassa et al.,1992; Ishimizu et al.,1999; Tomimoto et al.,1996 - هدف از انجام این پژوهش تعیین خود و دگر - نا - - سازگاري برخی از ارقام گلابی آسیایی و همچنین برخی گلابیهاي بومی پرورش یافته در ایران از طریق مشاهده رشد لولهي گرده به کمک میکروسکوپ فلئورسنس و تکثیر آلل هاي ناسازگاري به کمک روش PCR بود. خودناسازگار در نظر گرفته شدند.
در تیمارهاي دگرگردهافشانی نیز تلاقیهاي KS6♀ × KS13♂ و KS13♀ × KS12♂ به عنوان تلاقیهاي ناسازگار در نظر گرفته شدند. چون در آنها تعداد مادگیهایی که حداقل داراي یک لولهي گرده در انتهاي خامه بودند به ترتیب 16/5 و 14/5 و کمتر از 25 درصد بودند. سایر تلاقیها به عنوان تلاقیهاي سازگار در نظر گرفته شدند. که در آنها در اغلب موارد - بیشتر از 25 درصد از مادگیها - لولههاي گرده به انتهاي خامه رسیدند. قطعات S-RNases از نه رقم گلابی آسیایی و دو رقم بومی مورد بررسی تکثیر شدند و به وسیله ي AGE و PAGE جداسازي شدند - شکل - 3 در AGE دو نوع باند براي ارقام مشخص شد یک باند کوتاه که احتمالا مربوط به یکی از آلل هاي S1، S3، S4، S5، S6، S7 یا S8-RNase است و یک باند بلند که مربوط به یکی از آلل هاي S2 یا S9-RNaseاست، همانطور که قبلاً توصیف شده اند .
- Ishimizu et al., 1999 - رقم ‘Shahmiveh’ باندي تولید نکرد که این امر ممکن است به علت نامناسب بودن کیفیت DNA و یا عدم توانایی این دو آغازگر در تشخیص آلل خودناسازگاري آن باشد. از طرفی دیگر جداسازي قطعات S-RNase با PAGE جداسازي تک باند مشاهده شده در AGE در دو رقم ‘KS8’ و ‘KS12’ را به دو باند مجزا امکان پذیر ساخت - شکل . - 3 به طور کلی آغازگرهاي ‘FTQQYQ’ و ‘anti-IIWPNV’ توانستند ژن هاي S-RNase را در ارقام مورد نظر تکثیر کنند و نتایج نشان داد که ژن خودناسازگاري در ارقام مورد مطالعه وجود دارد.
در خودناسازگاري گامتوفیتی که از ویژگیهاي خانواده گلسرخیان است، عنوان می شود که رشد لولههاي گرده معمولاً در یک سوم بالایی خامه متوقف می شود - De Nettancourt, 1997 - با این حال ما در این پژوهش مشاهده نمودیم که در ارقام خود-ناسازگار ‘KS6’، ‘KS7’، ‘KS10’ و ‘KS11’ لولههاي گرده در یک سوم میانی خامه متوقف شدند. و در ارقام ‘KS9’، ‘KS12’، ‘KS14’ لولههاي گرده در یک سوم انتهایی خامه متوقف شدند. دو رقم بومی ‘Shahmiveh’ و ‘Sebri’ رفتار متفاوتی نسبت به سایرین داشتند و در این دو رقم لولههاي گرده در یک سوم بالایی خامه متوقف شدند.
