بخشی از مقاله
چکیده:
تولید میوه بادام و طراحی تلاقی به تعیین روابط ناسازگاري ارقام، که ناشی از فعالیت ریبونوکلئازي S-RNase بادام در سیستم خودناسازگاري - SI - 1 میباشد، نیازمند است. تعیین روابط ناسازگاري ارقام با استفاده از بررسی الگوي نواري ریبونوکلئازهاي S-RNase در واکنش PCR و زیموگرام2 و بدنبال آن انجام گرده افشانی آزمون در مزرعه امکانپذیر میگردد. ارقامی که ژنوتیپ S مشابهی دارند در یک گروه دگرناسازگارCIGs 3 قرار میگیرند.
تا امروز 39 آلل S-RNase و 28 گروه CIGs در بادام شناسایی شده که اغلب شامل ارقام بادام آمریکایی و مدیترانه میباشند. با توجه به چند شکلی آللی زیاد ژن S-RNase این تعداد با افزایش حوزه جغرافیایی مطالعات تعیین ژنوتیپ S افزایش خواهد یافت. گسترش دامنه این مطالعات به سمت ارقام محلی در مناطق جغرافیایی مختلف میتواند به اصلاح یا پرورش جهانی بادام و ایجاد یک کلکسیون مرکزي کمک نماید.
ایران علاوه بر نزدیکی به خاستگاه بادام یعنی خاورمیانه داراي تنوع اقلیمی زیاد بوده و منبع غنی از واریتههاي گوناگون بادام میباشد که فقط برخی از آنها کشت میشوند، در حالی که هنوز ژنوتیپ S آنها به طور صحیح شناسایی و تایید نشده است. در این مقاله ژنوتیپ 20 S رقم بادام ایرانی بررسی شد و دو آلل S-RNase جدید - تحت نامهاي S40 و - S41 در گونه Prunus dulcis شناسایی گردید. علاوه بر این بررسیها نشان میدهد که 7 رقم بادام ایرانی داراي ژنوتیپ منحصربه فرد بوده و احتمالاً سرمایه جهانی با ارزشی هستند. نتایج دو گروه دگرناسازگار جدید - S1S2 - ΧΧІΧ شامل دو رقم ‘Cristomorto’ و ’سهند‘ و گروه - S3S4 - XXX شامل دو رقم ‘Ai’ و ’شاهرودي‘1 را نیز پیشنهاد مینماید.
معرفی:
بادام یکی از محصولات درختی آجیلی بسیار مهم خانواده رزاسه1 است که اصلاح و پرورش آن از نظر ارزش اقتصادي یکی از موضوعات بسیار جالب تحقیقاتی است . - 4 - خودناسازگاري به واسطه فعالیت ریبونوکلئازي فرآورده ژن S-RNase بادام باعث شده، که به کارگیري روشهایی به منظور تعیین روابط ناسازگاري ارقام و هم چنین انتخاب ارقام دگرسازگار ضروري باشد.
روشهاي بسیار معمول مورد استفاده براي شناسایی آللهاي S ارقام بادام عبارتند از: تهیه زیموگرام پروتئینهاي خامه و به دنبال آن رنگآمیزي ژل IEF براي فعالیت ریبونوکلئازي ژن 1 - S-RNase و - 7، دوم بررسی فرآورده ژن S-RNase بر اساس واکنش PCR و بدنبال آن اختصاص هر قطعه تکثیر یافته - بر اساس اندازه قطعه - به یک آلل 9 - S و - 10 و سوم انجام گرده افشانیهاي آزمون در مزرعه
علاوه بر این توالییابی فرآورده واکنش PCR آلل S-RNase نیاز اصلی براي تفکیک و شناسایی دقیق آللهاي S-RNase میباشد 2 - ، 3، 10 و . - 13 ارقامی که ژنوتیپ S یکسانی دارند در یک گروه دگرناسازگار - CIG - قرار گرفته و سپس توسط گردهافشانیهاي آزمون در مزرعه مورد بررسی قرار میگیرند. تا به امروز تعداد آللهاي S به 39 و تعداد گروههاي دگرناسازگار به 28 گروه افزایش یافته که اغلب مربوط به ارقام بادام آمریکایی و مدیترانهایی است 5 - ، 6 و . - 10 با توجه به چندشکلی آللی زیاد ژن S-RNase انتظار میرود که تعداد آللها و همچنین گروههاي دگرناسازگار با افزایش دامنه تحقیقات ژنوتیپ S به ارقام محلی در نواحی جغرافیایی مختلف و طراحی تلاقیهاي جدید افزایش یابد.
انتظار میرود که با تداوم تحقیقات تعیین ژنوتیپ S ارقام محلی در نواحی جغرافیایی مختلف و با طراحی تلاقیهاي جدید این تعداد افزایش خواهد یافت. ایران علاوه بر نزدیکی به خاستگاه بادام یعنی خاورمیانه، داراي تنوع اقلیمی زیاد و منبع غنی واریتههاي گوناگون بادام میباشد که تنها برخی از این ارقام کشت میشوند، در حالی که ژنوتیپ S آنها هنوز به طور صحیح شناسایی و تایید نشده است. در این مقاله ژنوتیپ 20 S رقم بادام ایرانی از طریق تکثیر طول اینترون اول و دوم، توالییابی طول کامل 5 آلل S-RNaseبررسی شده است.
مواد و روش ها:
DNA ژنومی 20 رقم بادام ایرانی با روش تغییر یافته CTAB استخراج گردید. واکنش PCR با استفاده از جفت آغازگر - 11 - PaConsІ-F و - 12 - EM-PC1consRD براي بسط اینترون اول، آغازگرهاي EM-PC2consFD و - 9 - EM-PC3consRD براي بسط اینترون دوم و جفت آغازگر PaConsІ-F و - 10 - EM-PC5consRD براي تکثیر طول کامل و توالییابی انجام شد.
واکنشهاي بالا در حجم 20 میکرولیتر شامل 1x PCR Buffer، 250µM dNTPs، 0.4 µM of each Primer، 1.25 U Taq Polymerase، 2 mM MgCl 2، 5% DMSO و 100 ng DNA انجام شد. مارکر bpِ DNA 100 به عنوان نشانگر استاندارد مورد استفاده قرار گرفت . - 9 - فرآورده واکنشهاي مربوط به تکثیر اینترون اول و دوم در ژل آگارز 1/5 درصد الکتروفورز شدند و فرآوردههاي مربوط به بسط طول کامل آللهاي S پس از خالصسازي درون حامل پلاسمیدي pTZ57R/T کلون گردید، ورود قطعه از طریق PCR با آغازگرهاي M13 تایید و از هر آلل دو کلون توالییابی شد. توالیهاي DNA ژنومی تحت نام هايHQ622701, HQ622702, HQ622703, HQ622704, HQ622705 با توالیهاي موجود در NCBI توسط BLASTn و - http://www.ncbi.nlm.nim.nih.gov/ - BLASTp مقایسه شد.
نتایج و بحث:
بررسی ژنوتیپ S ارقام بادام مورد بررسی با استفاده از الگوي باندي فرآوردههاي PCR اینترون اول و دوم انجام شد 6 - و . - 7 اندازه نوارهاي مربوط به اینترون اول بینbp270 تا bp870 و اندازه نوارهاي تکثیر شده براي اینترون دوم بینbp450 تا bp1720 میباشد. الگوي نواري ارقام ایرانی نشان داد که همه ارقام تحت بررسی براي ژن S-RNase هتروزیگوت هستند. دو آلل S جدید هک قبلاً در گونه Prunus dulcis گزارش نشده است به صورت S40-RNase و S41-RNase نامگذاري شد. آلل S40- - S3S4 - XXX اختصاص داد.
RNase که در رقم ’شیر بادام‘ شناسایی شد داراي طول bp1381 - از ناحیه سیگنال پپتید تا ناحیه - C5 شامل: اینترون اول به طول bp110 و اینترون دوم به طول bp300 میباشد. آلل S41-RNase در رقم ’حاجی بادام‘ داراي طول کامل bp1340 شامل: bp304 براي اینترون اول و bp438 براي اینترون دوم است. بررسی BLAST نشان داد که آلل S40-RNase از نظر توالی نوکلئوتیدي 97 درصد با آلل Sk-RNase رقم ‘Gargano-5’ و آللS41-RNase، 99 درصد با آلل S10-RNase گونه Prunus Webbii شباهت دارند.
آلل S40-RNase داراي bp6 حذف/اضافه در اگزون دوم و در نتیجه در توالی اسید آمینه خود حاوي دو اسید آمینه اضافی در ناحیه RHV نسبت به رقم ‘Gargano-5’ گونه Prunus Webbii - با 95 درصد شباهت در توالی اسید آمینه - میباشد. هم چنین چندین فرآورده PCRدیگر با طول متفاوت از آن چه قبلاً با چنین آغازگرهایی گزارش نشده بود در سایر ارقام تکثیر یافت که به صورت S42? تا S46? نامگذاري شد، که 7 رقم بادام ایرانی داراي ژنوتیپ S منحصربهفرد بوده و احتمالاً سرمایه جهانی با ارزشی باشند.
به خوبی مشخص شده که در جنس Prunus اینتروگرسیون آللی از یک گونه به گونه هاي دیگر باعث یکسانی آللی زیاد در گونههاي مختلف گردد. با توجه به شباهت نوکلئوتیدي زیاد آللهاي جدید گونه P. S40-RNase - dulcis و - S41-RNase با S-RNaseهاي گونه Prunus Webbii میتوان گفت که این آللها از آخرین جد مشترك خود به ارث رسیدهاند و یا این که از طریق اینتروگرسیون از یک گونه به دیگري معرفی شدهاند.
پاسخ قطعی به این سوال به بررسی ریزماهواره DNA ژنومی و یا مطالعات فیلوژنتیکی نیازمند است. علاوهبراین، چنین بررسیهایی میتواند اطلاعات خوبی راجع به این که امکان وقوع حذف یا اضافه در مورد کدونهاي اضافه شناسایی شده در S40-RNase رقم ’شیر بادام‘ در مقایسه با آلل Sk-RNase رقم ‘Gargano-5’ ارائه دهد. ژنوتیپ S رقم ’سهند - S1S2 - ‘ مشابه ژنوتیپ S رقم ‘Cristomorto’ که - قبلاً به گروه O تعلق داشت - بوده، در نتیجه میتوان این دو رقم را به گروه دگرناسازگار جدید - S1S2 - ΧΧІΧ و دو رقم ‘Ai’ که - قبلاً به گروه O تعلق داشت - و ’شاهرودي‘1 تقسیم کرد.
