بخشی از مقاله
چکیده
باردهی درخت گلابی - Pyrus communis L. - متأثر از عامل ژنتیکی خودناسازگاري است، لذا کشت ارقام گردهزاي مناسب با سازگاري گرده به منظور تولید اقتصادي داراي اهمیت است. این تحقیق با هدف ردیابی آلل S1، به عنوان رایجترین آلل خودناسازگاري، در 25 رقم گلابی کلکسیون ملی کشور با استفاده از روش PCR-RFLP صورت گرفت. بدین منظور DNA ژنومی ارقام استخراج و مورد ارزیابی کمی و کیفی قرار گرفتند، سپس آللهاي خودناسازگاري با استفاده از جفت آغازگرهاي اختصاصی از پیش طراحی شده Sall-F و Sall-R1 و آغازگرهاي طراحی شده با استفاده از خطی کردن آللهاي S گونههاي مختلف گلابی، شامل جفتآغازگر FB-F و FB-R1 بهعنوان آزمون کنترل منفی و جفتآغازگر لانهگزینی شده FB-F و FB-R2 بهعنوان کنترل مثبت آزمایش، تکثیر شدند .
براي تأیید دقیقتر آلل خودناسازگاري S1، قطعات تکثیري صحیح تحت تاثیر آنزیمهاي برشی DraI، EcoRI، MspI و HaeIII قرار گرفتند. از میان ارقام مورد بررسی، جفت آغازگرهاي مورد استفاده توانستند حضور آلل S1 را در 8 رقم بیروتی، قوسی، آمرود-2 ، آمرود-4، ساماردوك، کروشالون، بوره دیل و الکساندرین تأیید کرده و همبستگی میان فراونی این آلل در ارقام موجود در کشور را با جمعیت آللهاي S1 ارقام اروپایی به اثبات برسانند.
مقدمه
گلابی از خانوادهي گلسرخیان - Rosaceae - و زیر خانوادهي دانهدارها - Pomoideae - است - 11 - و پس از سیب مهمترین گیاه دانهدار ایران و جهان محسوب میشود . - 1 - میوهدهی در گلابی و بسیاري از دیگر اعضاي این خانواده تحت تأثیر عوامل متعدد محیطی و ژنتیکی از جمله خودناسازگاري قرار میگیرد - Gu et al., 2009 - که یکی از روشهاي حفاظتی در برابر خودلقاحی و پسروي ژنتیکی گونهها است . - 3 - گلابی، گیاهی با خودناسازگاري گامتوفیتیک است که توسط مکان ژنی S با بیش از 64 آلل کنترل میشود . - 2 - بهمنظور پیشگیري از تلاقیهاي بیثمر یا کمثمر، افزایش تولید میوه و همچنین امکان انجام تلاقیهاي مناسب در طرحهاي اصلاحی، شناسایی ژنوتیپهاي خودناسازگار و دگرناسازگار ضروري است .
- 10 - در تعیین نوع و میزان ناسازگاري، استفاده از تکنیک PCR بهعنوان یک روش سریع و ساده، ضمن شناسایی دقیق نوع آللهاي S، امکان تفکیک ارقام سازگار از ناسازگار را فراهم میآورد. بر اساس یک مطالعهي جامع مروري انجام شده بر روي جمعیت آلل هاي خودناسازگاري، ثابت شد که آلل S1 با جمعیتی برابر 28/9 درصد، بالاترین مقدار آللهاي S را در ارقام اروپایی به خود اختصاص میدهد . - 4 - در دو پژوهش انجام شده در سال 2002 و 2009، به ترتیب در 7 و 9 رقم مورد مطالعه، 4 رقم حامل آلل S1 معرفی شدند . - 8 - تاسیناري و سانساوینی - 2005 - ، دو آلل S1 را در 10 رقم مورد بررسی شناسایی کردند. همچنین موتا و همکارانش - 2007 - مجموعاًحضور 6 آلل S1 را در 14 رقم اروپایی ثابت کردند.
ارقام گلابی موجود در کلکسیون ملی گلابی ایستگاه تحقیقات باغبانی موسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر کشور شامل 56 رقم وارداتی و 38 رقم بومی است که بر اساس برآوردهاي صورت گرفته، اکثریت این ارقام متعلق به گونهي اروپایی P. communis هستند. این تحقیق با هدف شناسایی و ارزیابی فراوانی آلل S1، به عنوان رایجترین آلل خودناسازگاري در ارقام اروپایی، در 25 رقم این مجموعه، با استفاده از روش PCR و با بهکارگیري چندین آغازگر و آنزیم برشی صورت گرفت. بررسی فراوانی و مقایسهي همبستگی آن آلل با آلل نظیر آن در ارقام اروپایی، ضمن تأیید ارتباط ژنتیکی گونههاي داخلی با این ارقام، گامی مفید در انتخاب صحیحتر والد گرده دهنده و مادري جهت استفاده در پژوهشهاي اصلاحی، بهبود نقشهي کاشت و افزایش ثمردهی باغهاي این محصول خواهد بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی و استخراج :DNA
ارقام گلابی مورد استفاده در این تحقیق شامل 25 رقم موجود در ایستگاه تحقیقاتی کمالشهر وابسته به بخش تحقیقات باغبانی موسسه اصلاح و تهیه نهال وبذر بود. به منظور استخراج DNAي ژنومی، برگهاي جوان و سالم در انتهاي اردیبهشت ماه برداشت و تا زمان استخراج، در -70 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. استخراج DNAي ژنومی با استفاده از روش تلفیقی CTAB-SDS صورت گرفت .براي بررسی آللهاي خودناسازگاري از روش PCR و مقایسهي طول باندهاي حاصل از آن استفاده شد.
محصولات واکنش PCR، پس از تأیید صحت باند تکثیر شده در آزمونهاي کنترل مثبت و منفی، توسط 4 آنزیم برشی DraI، EcoRI، MspI و HaeIII بطور جداگانه و بر اساس الگوي پیشبینی شده مورد هضم قرار گرفتند. ارزیابی محصولات واکنش PCR و همچنین قطعات حاصل از واکنش هضم، با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز %2 در بافر TAE و رنگ آمیزي در اتیدیوم بروماید انجام شد. نتایج نهایی واکنش جهت انجام بررسیهاي آماري در نرمافزار Excel ارزیابی شدند.
نتایج و بحث
الکتروفورز محصول PCR مشخص کرد که آغازگرهاي مورد استفاده FB - و - Sallمجموعاً توانستهاند آللهاي خودناسازگاري را در کلیه ارقام مورد بررسی تکثیر کنند. ضمن آنکه در 8 رقم بیروتی، قوسی، آمرود-2، آمرود-4، ساماردوك، کروشالون، بورهدیل و الکساندرین1، در اولین مرحله، تکثیر باندي به طول 1134 جفتباز در واکنش جفتآغازگر Sall-Sall-R1/F، گویاي حضور آلل S1 بود. صحت باند تکثیر شده با استفاده از جفت آغازگر لانهگزینی شده FB-F/FB-R2 با تکثیر باندي به طول 936 جفتباز و همچنین ایجاد حداکثر یک باند در آزمون کنترل منفی با استفاده از جفت آغازگر FB-FB-F/R1 تأیید شد.
محصولات دو واکنش اول، به منظور تأیید نهایی باندهاي تکثیر شده، مورد هضم 4 آنزیم برشی DraI، EcoRI، MspI و HaeIII قرار گرفته و با الگوي پیشبینی شده در نرم افزار OLIGO براي آللS1 مقایسه شدند. نتایج نهایی واکنش هضم بر روي محصولات واکنش PCR اول و همچنین واکنش لانهگزینی شده، حضور آلل S1 را در 8 رقم از مجموع 25 رقم مورد مطالعه به اثبات رساند - جدول. - 1 مقایسهي آماري درصد آللهاي شناسایی شده در جمعیت آللهاي خودناسازگاري ارقام گلابی اروپایی بیانگر وجود نوعی همبستگی مثبت بود. این همبستگی با ضریب 95/9 درصد علاوه بر اثبات ارتباط ژنتیکی گونههاي داخلی با این ارقام، با در نظر گرفتن فراوانی بالاي آلل S1 در این گونه، جهت انتخاب صحیحتر والد گرده دهنده و مادري بهمنظور استفاده در پژوهشهاي اصلاحی، بهبود نقشهي کاشت و افزایش ثمردهی باغات مثمر ثمر خواهد بود - شکل. - 1
