بخشی از مقاله
*** این فایل شامل تعدادی فرمول می باشد و در سایت قابل نمایش نیست ***
توليد متيونين با استفاده از تخمير
چکيده
متيونين يکي از آمينواسيدهاي ضروري در رژيم غذايي انسان و دام مي باشد که به رشد و متابوليسم طبيعي بدن کمک مي کند. متيونين پيش ساز ساير آمينواسيدهاي گوگردي است و نقش مهمي را در بدن انسان بازي مي کند. در نتيجه کمبود متيونين ، بيماريها و عوارض بدي در بدن ايجاد مي شود. پروتئين هاي گياهي، اغلب دچار کمبود متيونين هستند و منحصرا استفاده از مواد غذايي گياهي ممکن است قادر به برآورده کردن نيازهاي تغذيه اي نباشد. اين کمبود مي تواند بوسيله مکمل هاي رژيم غذايي مرتفع شود. در حال حاضر، متيونين يا با سنتز شيميايي و يا با هيدروليز پروتئين توليد مي شود. بعضي از آمينواسيدهاي ضروري نظير گلوتاميک اسيد، ليزين ، ايزولوسين ، والين و ترئونين در حال حاضر در اشل صنعتي با استفاده از تخمير توسط کورينه باکتريوم توليد مي شوند، اما هيچ گزارشي از توليد متيونين در مقياس بزرگ بوسيله تخمير وجود ندارد. از آنجا که فرآيند تخمير به شکل ارزان ، قادر به توليد اسيدهاي آمينه ديگر مي باشد، علاقه مندي زيادي در توسعه فرآيند ميکروبي در جهت توليد تجاري متيونين وجود دارد.در اين مقاله مروري، به موضوعاتي در زمينه توليد متيونين به روش تخميرپرداخته مي شود. در واقع ، هدف از ارائه اين مقاله ، ارتقاء دانش در زمينه توسعه توليد متيونين در اشل صنعتي مي باشد.
واژه هاي کليدي:متيونين ، آمينواسيدهاي ضروري، تخمير
مقدمه
متيونين يکي از آمينواسيدهاي ضروري در رژيم غذايي انسان و دام مي باشد که به رشد و متابوليسم طبيعي کمک مي کند. متيونين پيش ساز ساير آمينواسيدهاي گوگردي، سيستئين ،تائورين و گلوتاتيون است و نقش مهمي را در بدن انسان با کمک به تجزيه چربي و جلوگيري از ساخته شدن چربي در کبد و عروق بازي مي کند. در نتيجه کمبود متيونين ، بدن با تعدادي از بيماريها نظير زوال کبد(بيماري پارکينسون )، نقص لوله هاي عصبي، افسردگي، مسموميت ، تب روماتيسمي در دوران کودکي، فلج عضلاني، ريزش مو، اسکيزوفرنيو اختلال در رشد همراه است . پروتئين هاي گياهي، اغلب دچار کمبود متيونين هستند و منحصرا استفاده از مواد غذايي گياهي ممکن است قادر به برآورده کردن نيازهاي تغذيه اي نباشد. اين کمبود مي تواند بوسيله مکمل هاي رژيم غذايي مرتفع شود[١٧و١٨]. در آوريل سال ٢٠٠٠،کميته ارزيابي داروهاي مکملتوصيه کرده که ال -متيونين براي استفاده به عنوان يک جزء در داروها مناسب است و هيچ محدوديتي در استفاده از آن وجود ندارد. متيونين بطور گسترده در صنعت مرغ و خوراک دام استفاده مي شود؛ بنابراين تقاضا براي ال -متيونين بطور قابل ملاحظه اي افزايش يافته است [١٠و١٨] . از آنجا که فرآيند تخمير به شکل ارزان قادر به توليد اسيدهاي آمينه ديگر مي باشد؛ علاقه مندي زيادي در توسعه فرآيند ميکروبي در جهت توليد تجاري متيونين وجود دارد[٢١]. در حال حاضر، متيونين يا با سنتز شيميايي و يا باهيدروليز پروتئين توليد مي شود. سنتز شيميايي مخلوطي از دي و ال - متيونين توليد مي کند، در حاليکه هيدروليز پروتئين منجر به توليد مخلوط پيچيده اي از متيونين مي شود[١٨و٢٧]. ال - متيونين فعال بيولوژيکي مي تواند يا با سنتز آنزيمي(تبديلات بيولوژيکي پيش سازها)، و يا تخمير غوطه وري با استفاده از ميکروارگانيسم ها توليد شود[٢٧].اگرچه فرآيندهاي آنزيمي موجود به راندمان خوبي دسترسي پيدا مي کنند، ولي احتياج به سوبستراهاي گراني دارند[٨]؛ بنابراين اگرفرايند بتواند به صورت مقرون بصرفه درآيد، مي تواند نسبت به فرايندهاي شيميايي مزاياي متمايزي داشته باشد، چون ميکروارگانيسم ها ذاتا فرم ال آمينواسيدها را که از نظر بيولوژيکي فعال هستند توليد مي کنند. بعضي از آمينواسيدهاي ضروري نظير گلوتاميک اسيد، ليزين ، ايزولوسين ، والين و ترئونين در حال حاضر در اشل صنعتي با استفاده از تخمير توسط کورينه باکتريوم توليد مي شوند، اما هيچ گزارشي از توليد متيونين در مقياس بزرگ بوسيله تخمير وجود ندارد[١٨]. بنابراين در اين مقاله به تشريح توليد اين اسيدآمينه مي پردازيم .
توليد متيونين به روش شيميايي
مسيرهاي شيميايي براي سنتز متيونين ، مخلوطي از آمينواسيدها به فرم D,L توليد مي کنند. در حال حاضر، تمام اين مسيرها اصلاح شده سنتز استرکر مي باشند، و آنها همان مواد خام را به اشتراک مي گذارند: آکرولئين ، متيل مرکاپتان ، همراه با منابع مختلفي از آمونياک و سيانيد، در حضور کاتاليست ، روش ديگر از پروپيلن ، هيدروژن سولفيد، متان و آمونياک استفاده مي کند تا واسطه هايي مثل آکرولئين ، متيل تيول و هيدروسيانيک اسيد را توليد کنند. طبق گزارش موجود در يک فرايند پاتنت ، ٣-متيل -مرکاپتوپروپيون آلدئيد با آمونياک ، هيدروژن سيانيد و دي اکسيد کربن در حضور آب در سه مرحله واکنش مي دهد. آنالوگ هاي هيدروکسي دي و ال -متيونين هم توليد مي شوند و بطور تجاري استفاده مي شوند. آنالوگ هاي هيدروکسي با ترانس آميناسيون در کبد پرندگان و حيوانات ، با استفاده از آمينواسيدهاي غيرضروري نظير گلوتاميک اسيد، تبديل به فرم آمينواسيد مي شوند. استفاده از متيونين و ديگر ترکيبات مصنوعي در خوراک حيوانات ، آماده سازي و فرمولاسيون ساده اي دارد، اما سنتز دي و ال - متيونين و آنالوگ هاي هيدروکسيدي و ال -متيونين براي اين منظوربا روش هاي شيميايي باعث آلودگي محيط مي شود؛ بنابراين ، روش هاي بيولوژيکي جايگزين براي توليد ال -متيونين بيشتر قابل پذيرش خواهد بود[١٣] .لازم به ذکر است که در حال حاضر،مقدار متيونيني که با فرايند شيميايي يا از طريق تبديل پيش سازها توليد مي شود، تقريبا به ٨٥٠٠٠ تن در سال مي رسد[٧] .
انتخاب ميکروارگانيسم ها براي توليد ال - متيونين
تقاضاي سالانه براي آمينواسيد بطور پيوسته در حال افزايش است (با نرخ تقاضاي سالانه ٧-٥%)[٧]. براي ايجاد يک فرآيند تجاري مقرون به صرفه به منظور توليد ميکروبي متيونين ، بايد يک ارگانيسم با توانايي توليد بالا يافت شود يا بتوان آنها را توليد کرد. سويه هاي وحشي معمولا قادر به توليد مقدار قابل توجهي از متيونين نمي باشند، چون سيستم بيوسنتزي آنها بسيار تنظيم شده است [١٧]. تخمير متيونين بطور قابل توجهي متفاوت از تخميرهاي متعارف ديگر مثل توليد اتانول ، لاکتيک اسيد و اسيدسيتريک است . برخلاف اتانول و اسيدلاکتيک که محصولات جانبي در مسيرهاي مورد استفاده براي توليد ATP هستند، سنتز متيونين نياز به انرژي(ATP) دارد؛ بنابراين توليد بيش از حد متيونين براي ميکروارگانيسم ها بي فايده است و تنها متيونين مورد نياز براي رشدشان را توليد مي کنند[٢٥].
توليد متيونين بوسيله ميکروارگانيسم ها در اشرشياکلاي، ساکارومايسز سرويزيه ، مخمر متيلوتروف اجباري و کورينه باکتريوم گلوتاميکوم مطالعه شده است . به خصوص ، کومار و همکاران يک سويه کورينه باکتريوم گلوتاميکوم مقاوم به آنالوگ چندگانه (اتيونين ،نورلوسين ،متيونين سولفوکسايد و متيل متيونين سولفونيوم کلرايد) را گزارش داده اند که g.l ٣.٣٩ متيونين تحت شرايط مکمل سازي با سيستئين توليد مي کند. جداي از روش متداول به کارگيري آنالوگ هاي آمينواسيد، تکنيک هاي مهندسي ژنتيک براي توسعه سويه هاي کورينه باکتريوم گلوتاميکوم توليد کننده متيونين ارائه شده اند.عليرغم اين تلاش ها، راندمان دست يافته متيونين بوسيله ارگانيسم ها هنوز به يک سطح مناسب براي تجاري شدن نرسيده است [٧].
مشاهده شده که سويه هاي کورينه باکتريوم و بروي باکتريوم مکانيسم هاي تنظيم کننده ي ساده تري نسبت به E.coli براي توليد متيونين دارند که تمام آنزيم ها بوسيله محصولات نهايي مهار يا سرکوب مي شوند. اگر يک ارگانيسمي در محيط اسيدآمينه کمياب زندگي کند، تابع تنظيم بيوسنتز اسيدآمينه است تا سرعت توليدش را در پاسخ به سرعت رشد ارگانيسم تنظيم کند. وقتي متيونين اضافه توليد مي شود، به احتمال زياد، ترئونين ، ليزين و ايزولوسين توليد مي شوند، چون مسير متابوليکي يکساني در توليد آنها دخيل مي باشد. تمام تنظيم هاي عمده چنين مسيري را مي توان بوسيله سيستمي که در آن تنها تعداد کمي از محصولات نهايي فعاليت آنزيم متداول را مهار مي کنند دست يافت . در نتيجه بهتر است ، ميکروارگانيسم هايي که نسبتا مکانيسم هاي تنظيمي ساده اي دارند، براي توليد متيونين انتخاب شوند[١٧و٢١].
علاوه بر کورينه باکتريوم و بروي باکتريوم ، ميکروارگانيسم هاي پيچيده تر مثل لاکتوباسيل هاي خاص و مخمرها براي توليد متيونين و ليزين ارزيابي شده اند[٢١].
بيوسنتز متيونين در ميکروارگانيسم ها
متيونين ،ليزين ،ترئونينو ايزولوسين از اعضاي خانواده اسيدهاي آمينه آسپارتات هستند. مسيرهاي بيوسنتز آمينواسيدهاي اين خانواده توسط افراد مختلفي نشان داده شد. مسير بيوسنتز متيونين در ميکروارگانيسم هاي گوناگون ويژگيهاي مشترک زيادي داشتند . اکثر باکتريها و قارچها متيونين را سنتز مي کنند. به طور معمول آسپارتات بوسيله آسپارتات کيناز تبديل به ٤-فسفوآسپارتات مي شود و سپس بوسيله آسپارتات آلدئيد دهيدروژناز اکسيد مي شود تا تشکيل آسپارتات نيمه آلدئيد دهد. دومي(در حالت دوم ) بوسيله هوموسرين دهيدروژناز اکسيد مي شود تا توليد هوموسرين کند.
متناوبا آسپارتات نيمه آلدئيد بوسيله دي هيدروپيکولينات -سنتتاز تبديل به دي هيدروپيکولينات مي شود که منجر به تشکيل ليزين مي شود. از هوموسرين يک مسير متابوليکي منجر به توليد متيونين مي شود در حاليکه مسير ديگر منجر به ترئونين و سپس به ايزولوسين مي شود. هوموسرين تحت تراکم با سوکسينيل کوآنزيم A قرار مي گيرد تا توليد او-سوکسينيل هموسرين کند. آنزيم مسئول اين واکنش در اشرشياکلي، هموسرين او- سوکسينيل ترانسفراز است . اکثر باکتريها او-سوکسينيل هموسرين را به عنوان يک حد واسط توليد مي کنند. در مقابل ، اکثر قارچها و بعضي از باکتريها ( مثل باسيلوس و کورينه باکتريوم ) به جاي او-سوکسينيل هموسرين . توليد او-استيل هموسرين مي کنند[٩].تشکيل متيونين از او- استيل هموسرين ممکن است در دو مسير متابوليکي ممکن اتفاق بيفتد. در هر صورت فرم هاي هوموسيستئين يا از طريق سيستاتيونين تشکيل مي شود ( مثلا در بعضي از باکتريهاي روده اي و قارچهايي مثل نوروسپورا کروزا) يا استيل هموسرين مستقيما بوسيله او- استيل هموسرين (تيول )-لياز تبديل به هموسيستئين مي شود[١٥].
تنظيم متابوليکي بيوسنتز متيونين
تمام ميکروارگانيسم ها، مکانيسم هايي براي تنظيم مقدار و نوع آنزيم ها دارند ؛ بطوري که تنها مقدار مورد نياز اسيدهاي آمينه سنتز شوند. تنظيم متابوليکي بيوسنتز آمينواسيدهاي خانواده آسپارتات مطالعه شده است . آسپارتات کيناز(٢.٧.٢.٤ EC) نخستين آنزيم مسير متابوليکي است که آمينواسيدهاي خانواده آسپارتات را توليد مي کند. اين آنزيم ، فسفريلاسيون آسپارتات را کاتاليز مي کند[١٤].
گونه هاي بروي باکتريوم و تنظيم بسيار ساده تري از سنتز آمينواسيدهاي خانواده آسپارتات دارند. اين ميکروارگانيسم ها برخلاف اشرشياکلاي ، که سه تا آسپارتات کيناز مجزا براي کاتاليز واکنش هاي يکسان وجود دارند، تنها يک آسپارتات کيناز دارند که بوسيله ليزين و ترئونين در شيوه اي هماهنگ مهار مي شود بنابراين مهار بازخوردي کارآمد آسپارتات کيناز نياز به حضور همزمان ليزين و ترئونين دارد. وقتي ليزين و ترئونين به طور همزمان در غلظت mM١موجود باشند، آسپارتات کيناز را ٩٤% مهار مي کنند، در حاليکه حضور هريک از آمينواسيدها به تنهايي در غلظت mM١ آسپارتات کيناز را در ٢٠-١٢% مهار مي کند. مطالعات روي جنبه هاي تنظيم بيوسنتز متيونين در کورينه باکتريوم گلوتاميکوم نشان مي دهد که متيونين اگزوژن ، يک سرکوب کننده بالقوه سنتز بعضي از آنزيم هاي مسير است . آنزيمي که توليد استر هموسرين را کاتاليز مي کند، مورد هدف مهار بازخوردي بوسيله متيونين و S-آدنوزيل متيونين (SAM) در اشرشياکلاي و باسيلوس سوبتيليس است . با اين حال ، آرشر و همکاران (١٩٩١) گزارش شود. پس از آن ، ستون با آب ديونيزه ( آب مقطر) و NHOH٤ يک مولار شسته مي شود تا متيونين را بازيابي کنند. متيونين کريستالي مي تواند با کنسانتره کردن تحت خلأ ، تيمار با الکل خالص و خشک کردن شبانه در...٤بدست آيد[٢].
روش هاي تجزيه
تعدادي روش براي برآورد متيونين در محيط کشت مايع توسعه يافته است . اين روش ها شامل آناليز شيميايي،کروماتوگرافي کاغذي، تجزيه و تحليل رنگي، GLC،GC-MS ، طيف سنجي مادون قرمز تبادل يوني و HPLC مي باشد[١٣].
مدل سازي،شبيه سازي و کنترل
شبيه سازي ها معمولا براي پيش بيني رفتار فرايند تحت شرايط مختلف که ممکن است در صنعت با آن مواجه شد ، انجام مي شوند. در شبيه سازي، شرايط فرايند براساس شرايط آزمايشگاهي واقعي شبيه سازي مي شود که مي تواند در يک راکتور ١٥ ليتري با حجم کاري ماکسيمم ١٢ ليتري
موجود باشد.توليد متيونين بخوبي با مدل زير که وابستگي توليد متيونين به اکسيژن حل شده را توضيح مي دهد، توصيف مي شود.
که x مقدار بيومس ، s گلوکز باقيمانده ، p مقدار متيونين ، cl مقدار اکسيژن حل شده ، متغير هاي حالت فرايند را تشکيل مي دهند. سرعت رقيق سازي D و فلوريت هوا شامل ضريب انتقال دروني جرم اکسيژن kla، ورودي هاي خارجي فرايند هستند[١٣].
نتيجه گيري کلي
متيونين به علت افزايش کاربرد ، بسيار مورد تقاضا مي باشد. فرايند تخمير مي تواند بدون توليد مواد خطرناک در توليد اقتصادي اين اسيد آمينه مفيد باشد. اما به دليل دانش کم در زمينه اين فرايند و تنظيم بازخوردي بيوسنتز متيونين ، هيچ فرايند تجاري شده وجود ندارد. روش هاي کلاسيک ايزوله کردن گونه هاي با راندمان بالا با جهش زايي عموميدر توليد زياد متيونين موفق نيست .يکي از دلايل آن کافي نبودن جذب سولفور مي باشد.فرايندهاي سولفيدراسيون مستقيم ، ترانس سولفوراسيون و ترانس سولفوراسيون معکوس نقش قابل ملاحظه اي در بيوسنتز متيونين و دفع آن از سلول بازي مي کنند. همچنين ايزوله کردن اگزوتروف دوگانه ليزين و ترئونين مي تواند بر تنظيم بازخوردي نامطلوب بخاطر ليزين و ترئونين غلبه کند. البته اين موتانت ها بايد سيستم هاي آنزيمي تنظيم شده داشته باشند که به مهار بازخوردي يا سرکوبي بوسيله متيونين و سيستئين غيرحساسند.
