بخشی از مقاله
چکیده
تخمیر حالت جامد تکنولوژي است که تبدیل ضایعات کشاورزي- صنعتی را به محصولات با ارزش میسر میسازد. با توجه به نیاز تولید اقتصادي بیوسورفکتانتها از این ضایعات، پژوهش حاضر به بررسی امکان تولید رامنولیپید با استفاده از کشت حالت جامد گونهي ایزوله شدهي سودوموناس آروجینوزا در مقیاس آزمایشگاهی، اختصاص یافته است. تولید بیوسورفکتانت با استفاده از مخلوط 50:50 - w/w - سبوس و کنجالهي جرم ذرت مورد آزمایش قرار گرفته است. میزان بیوسورفکتانت تولیدي پس از گذشت 72 ساعت به 2 گرم رامنولیپید در هر کیلوگرم از سوبستراي خشک اولیه رسید. کششسطحی مایع رویی از 44 به 36 mN/m کاهش یافت و شاخص امولسیونسازي 24 ساعته گازوئیل و بنزین برابر با 75٪ حاصل شد.
کلمات کلیدي: تخمیر حالت جامد، بیوسورفکتانت، رامنولیپید، سبوس و کنجالهي جرم ذرت
.1 مقدمه
بیوسورفکتانتها ترکیبات دوگانهدوستی 1 هستند که توسط میکروارگانیسمها تولید میشوند و داراي فعالیت سطحی میباشند .[1] در حال حاضر، کاربرد سورفکتانتهاي شیمیایی در صنایع نفت به منظور پاکسازي آلایندههاي نفتی و ازدیاد برداشت از مخازن، بسیار مورد توجه قرار گرفته است،اما اخیراًتمایل به جایگزینی آنها با سورفکتانتهایی با منشاء زیستی که سمیت کمتري دارند و زیست تخریبپذیرترند، افزایش یافته است. علیرغم توانایی بالقوهي آنها، کاربرد بیوسورفکتانتها در این صنایع محدود است و مهمترین دلیلش این است که هزینهيتولید آنها حدوداً سه تا ده برابر بیش از رقباي شیمیایی آنهاست، در نتیجهفرآیندهاي اندکی جهت تولید بیوسورفکتانتها در مقیاس صنعتی وجود دارد .[2]
رامنولیپیدها دستهاي از بیوسورفکتانتهاي گلایکولیپیدي هستندکه عمدتاً توسط باکتري گرم منفی سودوموناس آروجینوزا تولید میشوند و از یک سر آبدوست حاوي یک یا دو مولکول رامنوز و یک دنبالهي آبگریز شامل یک یا دو اسید چرب تشکیل شدهاند و داراي ویژگیهاي منحصر به فردي هستند. علاوه بر آنکه میزان تولید بالاتري در مقایسه با سایر بیوسورفکتانتها نشان میدهند، از سوبسترا هاي ارزان قیمت و عمدتا پسماند و ضایعات حاصل از صنایع مختلف غذایی مانند روغن استفاده شده و کنجالههاي باقیمانده به عنوان منبع کربنی براي تولید آنها استفاده میشود. رامنولیپیدها قادرند کشش سطحی آب- هوا را از 72 به حدود 30 N/m کاهش دهند و همچنین کشش بین سطحی آب-روغن را از 43 به حدود 1 mN/m کاهش دهند. از دیدگاه زیستمحیطی و اقتصادي، در دهه هاي اخیر تبدیل صنعتی منابع تجدیدپذیر به ترکیبات مفید، بسیار مورد توجه قرار گرفته است.
این منابع، روغنها، قندها، سلولز و لیگنوسلولز و همچنین انواع ضایعات آلی حاصل از کشاورزي و صنایع مرتبط را در بر میگیرد .[3] مناسبترین روش تخمیر با استفاده از ضایعات کشاورزي، تخمیر حالت جامد میباشد. بنابراین، هدف از این پژوهش ارزیابی تولید بیوسورفکتانت از گونهي ایزوله شدهي س. آروجینوزا به روش تخمیر حالت جامد میباشد که کشت آن بر روي مخلوط سبوس و کنجاله ي جرم ذرت به عنوان منبع کربنی صورت گرفته است. در حال حاضر از این سوبسترا که محصول جانبی فرآیند روغنکشی از ذرت است،عمدتاً به عنوان خوراك دام استفاده میشود.
.2 مواد و روشها
.1-2 گونهي باکتریایی و تهیهي کشت بذر
گونهي ایزوله شدهي س. آروجینوز، جدا شده از لجن نفتی یکی از میادین نفتی جنوب کشور در آزمایشگاه تحقیقاتی بیوتکنولوژي دانشگاه علم و صنعت ایران، در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفته است. این باکتري بر روي اسلنتهاي حاوي نوترینت آگار در ºC 4 نگهداري میشود. به منظور تهیهي کشت بذر، گونهي باکتریایی از کشت 24 ساعته بر روي نوترینت آگار، به 50 ml از محیطکشت LB1 منتقل شده است. شرایط کشت به منظور تهیهي کشت بذر 35 ºC، 150 rpmو زمان گرماگذاري برابر با 15 ساعت بوده است.
.2-2 تولید رامنولیپید در تخمیر حالت جامد
هر یک از ارلنهاي 250 ml، حاوي 4 g مخلوط 50:50 - m/m - سبوس و کنجالهي جرم ذرت بوده است. ارلنها پس از سترون سازي با اتوکلاو در 121 ºC به مدت 20 min، تلقیح و به مدت 72 ساعت در 35 ºC گرماگذاري شدند. pH اولیه سوبسترا با استفاده از محلول NaOH در مقدار 6/8 و رطوبت اولیه سوبسترا در 70٪ تنظیم شد.
.3-2 استخراج رامنولیپید از کشت حالت جامد
به ازاي هر گرم از سوبستراي تخمیر شده، 8 ml آب مقطر اضافه شد و عمل اختلاط در 30 ºC و 200 rpm به مدت 1 h در شیکر اربیتالی صورت گرفت. پس از فیلتراسیون سوسپانسیون حاصل، مایع فیلترشده به مدت 20 min در 10000 rpm سانتریفیوژ شد. pH مایع رویی با استفاده از HCl در مقدار 2 تنظیم و به مدت یک شب در یخچال قرار داده شد. سپس رسوب حاصله با استفاده از حجم یکسانی از کلروفرم- متانل - 2:1 - استخراج شد و فاز آلی تا حصول بیوسورفکتانت خام، تغلیظ شد.
.4-2 اندازهگیري میزان رامنولیپید تولیدي
میزان رامنولیپید تولیدي از طریق اندازهگیري مقدار رامنوز با به کارگیري روش فنل - سولفوریک اسید [4]، با استفاده از رامنوز به عنوان استاندارد، محاسبه شد. از آنجایی که رامنوز تنها تشکیل دهندهي قسمتی از مولکول رامنولیپید است، به منظور بدست آوردن مقدار کل رامنولیپید، جرم رامنوز در یک ضریب تصحیح 3/2 ضرب شده است .[2]
.5-2 اندازهگیري میزان قند احیا
میزان قند احیاي کل در مایع رویی با استفاده از روش DNS اندازهگیري شد .[5]
.6-2خواص سطحی مایع رویی حاوي بیوسورفکتانت
اندازهگیري کششسطحی با استفاده از دستگاه تنسیومتر - Kruss K6, Germany - و به روش حلقه Du-Nouy در 25 ºC انجام شد. به منظور اندازهگیري شاخص امولسیونسازي 24 ساعته1، شش میلیلیتر از ترکیباتی نظیر گازوئیل و بنزین به چهار میلیلیتر از مایع رویی حاوي بیوسورفکتانت اضافه شد و هر کدام از مخلوطها به مدت 2 دقیقه با سرعت بالا همزده و به مدت 24 ساعت در دماي اتاق نگهداري شد. مقدار شاخص امولسیونسازي به صورت درصد لایهي امولسیون شده به کل ارتفاع ستون مایع محاسبه شد.
.3 نتایج و بحث
میزان رامنولیپید تولیدي، شاخص امولسیونسازي گازوئیل و بنزین و کاهش کششسطحی حاصل پس از گذشت 72 ساعت از آغاز تخمیر در جدول - 1 - آورده شده است. میزان رامنولیپید تولیدي در این پژوهش از این نظر که از ضایعات کشاورزي به عنوان سوبستراي ارزان قیمت استفاده شده است و هیچ گونه بهینهسازي شرایط تولید صورت نگرفته است، با پژوهشی که توسط لی و همکاران [6] با استفاده از پساب ناشی از تقطیر ملاس به عنوان منبع کربنی، صورت گرفته است و میزان رامنولیپید تولیدي آن g/l 2/6 بوده است، قابل مقایسه است. همچنین مایع رویی حاوي بیوسورفکتانت، داراي شاخص امولسیونسازي بالاتري نسبت به بسیاري از پژوهشهاي دیگر بوده است که میتوان به طور نمونه به مقدار53/7٪ گزارش شده توسط سیلوا و همکاران [3]
- با گازوئیل به عنوانهیدروکربن - و همچنین مقدار 64٪ گزارش شده توسط لی و همکاران [6] - با بنزین به عنوان هیدروکربن - اشاره کردمیزان. نسبتاً پایین کششسطحی مایع رویی در آغاز تخمیر میتواند به علت حضور ذرات کلوییدي و معلق حاصل از سبوس و جرم ذرت باشد که وارد فاز آبی شده است و در اثر تولید بیوسورفکتانت، در پایان ساعت 72، 8 واحد کاهش در کششسطحی حاصل شده است. همانطور که در شکل - 1 - مشاهده میشود، مقدار قند احیا در پایان ساعت 72 کاهش و مقدار pH افزایش یافته است. در پژوهشی که توسط کاستا و همکاران [7] با استفاده از یک نوع روغن برزیلی به عنوان سوبسترا براي س. آروجینوزا LBI صورت گرفته است، pH به مقادیر بالاتر از 8 رسیده است. رابرت و همکاران [8] که تولید رامنولیپید را با استفاده از پسماند حاصل از روغنگیري از زیتون به عنوان منبع کربنی، مورد بررسی قرار دادهاند نیز افزایش pH تا مقادیري در حدود 9 را گزارش نمودهاند.
