بخشی از مقاله
چکیده
ژنوم ویروس هپاتیت c حاوي یک قاب خواندن طویل کد کننده نوعی پلی پروتئین است که پس از پردازش به 10 پروتئین جداگانه تبدیل می شود.اخیرا نوعی پروتئین جدید به نام core+1 یا F پروتئین شرح داده شده که این پروتئین از طریق یک شیفت ریبوزومی در ناحیه کد کننده پروتئین core تولید می شود. در این مطالعه، به منظور تولید و تعیین ویژگی هاي فرم نوترکیب این پروتئین، سکانس DNA مربوط به ژن core+1 ، با روش PCR تکثیر گردید . ژن تکثیر شده در وکتور pET24-a کلون و در سویه هاي مختلف E.coli بیان گردید. پروتئین بیان شده در طی یک مرحله با استفاده از ستون کروماتوگرافی - - NI-NTA تخلیص شده و حدود 5mg پروتئین در هر لیتر از محیط کشت به شکل دناتوره به دست آمد.
پس از انجام مراحل بازیابی شکل طبیعی پروتئین ، F پروتئین بیان شده با روش هاي SDS-PAGE و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. ویژگی هاي آنتی ژنیک پروتئین با روش الایزا و با استفاده از سرم بیماران HCV تعیین گردید. ایمن سازي موش هاي BALB/c با F پروتئین، تیتر بالایی از پاسخ IgG را ایجاد کرد که قدرت پروتئین نوترکیب ایجاد شده براي القاء پاسخ هومورال را نشان می دهد. نتایج این مطالعه امکان تولید مقادیر بالاي پروتئین F نوترکیب در E.coli را فراهم کرد و براي اولین بار نشان می دهد که F پروتئین در مدل موشی ایمونوژن می باشد.
کلمات کلیدي: ویروس هپاتیت c، F پروتئین، ایمن سازي ،کلونینگ، بیان پروتئین
مقدمه
یکی از علل مهم نارسایی هاي مزمن کبدي،عفونت ناشی از ویروس هپاتیتc می باشد که عموما منجر به عوارضی مانند سیروز،انباشت چربی در کبد و در برخی موارد کارسینوم هپاتوسلولار می شود, و این در حالی است که تاکنون واکسن یا درمان موثري براي این ویروس معرفی نشده است - 1و. - 2 ژنوم این ویروس داراي طولی به اندازه 9600 نوکلئوتید بوده و پلی پروتئینی با 3000 اسید آمینه را کد می کند که این پلی پروتئین توسط پروتئاز بریده شده و 10 پروتئین جداگانه از آن به دست می آید . - 3 - اخیرا یک پروتئین جدید به نام F پروتئین یا core+1 در این ویروس شرح داده شده که در قاب خواندن +1 در ناحیه هم پوشان ژن core بیان می شود به طوري که به نظر می رسد در بیماري زایی این ویروس نقش داشته باشد - . - 6-4 برخی مطالعات توانسته اند آنتی بادي ضد این پروتئین را در سرم افراد آلوده به ویروس هپاتیت c شناسایی کنند - 6و. - 7 اما همچنان اطلاعات پیرامون ویژگی هاي F پروتئین و خصوصیات ایمنی زایی این پروتئین اندك می باشد. لذا در این مطالعه تلاش می شود ابتدا F پروتئین در سیستم پروکاریوتی بیان شده و پس از تخلیص ، خواص ایمنی زایی آن در مدل حیوانی موش BALB/c بررسی شود.
مواد و روش ها
در این مطالعه از سازه ژنی pIVEX2.3-HCVCP که در بر دارنده توالی ژن core ویروس هپاتیت C - ژنوتایپ - 1b می باشد به عنوان الگوي PCR جهت سنتز و تکثیر ژن F استفاده شد. به منظور تغییر چهار چوب خواندن و سنتز F پروتئین از روي ژن core ، طراحی پرایمر ها به نحوي صورت پذیرفت که از نوکلئوتید شماره 30 ژن core به بعد چارچوب خواندن به صورت +1 تغییر می کند. محصول PCR حاصل از تکثیر ژنF پروتئین در سایت برشی BamHI و XhoI در وکتور بیانی pET-24a کلون گردید. پس از تائید سازه ژنی با روش هضم آنزیمی و تعیین توالی ، سازه نوترکیب به منظور آنالیز بیان پروتئین به چهار سوش مختلف باکتري - BL21 - DE3 - , BL21 - DE3 - pLysS, Rosetta - DE3 - , - E.coli BL21-CodonPlus - DE3 - -RIL ترانسفورم گردید. باکتري هاي ترانسفورم شده پس از رشد در محیط LB حاوي آنتی بیوتیک کانامایسین و رسیدن به جذب نوري 0/7 در طول موج 600 نانومتر، با IPTG القاء گردید و سه ساعت پس از القاء بیان باکتري با روش SDS-PAGE بررسی گردید.
به منظور بهینه سازي شرایط بیان دماهاي مختلف بیان - 30،22 و 37 درجه - ، زمان هاي مختلف پس از القاء - از 1 تا 5 ساعت - و غلظت هاي مختلف 0/5 - IPTG ،1 و 1/5 میلی مولار - بررسی گردید. پس از به دست آوردن بهترین شرایط بیان، پروتئین نوترکیب با روش وسترن بلات در آزمایشات جداگانه اي با استفاده از آنتی بادي مونوکلونال ضد دنباله هیستیدینی، آنتی بادي پلی کلونال موشی ضد یکی از اپیتوپ هاي پروتئین F و آنتی بادي مونوکلونال ضد پروتئین core تائید گردید. به منظور بررسی ویژگی هاي آنتی ژنیسیته F پروتئین ، میانکنش پروتئین با آنتی بادي هاي ضد F پروتئین موجود در 11 سرم بیمار HCV با استفاده از روش الایزا تعیین شد.نهایتا به منظور تعیین ایمونوژن بودن F پروتئین در مدل موشیBALB/c ، 25 میکروگرم پروتئین در ترکیب با ادجوانت فروند به صورت زیر جلدي به قاعده دم موش ها، در سه نوبت با فاصله 3 هفته تزریق گردید.سپس از موش ها خونگیري شده و پاسخ آنتی بادي موش ها با روش الایزا تعیین گردید.
نتایج و بحث
پس از تکثیر ژن F پروتئین ، وارد کردن آن در وکتور pET24a ، با موفقیت انجام شده و صحت سازه ژنی با روش تعیین توالی و هضم آنزیمی تائید شد. آنالیز بیان نشان داد که این پروتئین در میزبان هاي BL21 - DE3 - و - Rosetta - DE3 بیان می گردد - شکل . - 1 بهترین شرایط بیان در دماي 37 درجه ، غلظت 1 IPTG میلی مولار و 3 ساعت پس از القاء است. این نتایج نشان می دهد که سازگاري هر میزبان با سازه ژنی در مورد بیان هر ژنی جداگانه باید بررسی گردد تا بهترین شرایط حاصل گردد.بررسی وسترن بلات باآنتی بادي مونوکلونال ضد دنباله هیستیدینی و آنتی بادي پلی کلونال موشی ضد یکی از اپیتوپ هاي پروتئین F ، صحت پروتئین و دارا بودن ویژگی آنتی ژنیسیته F پروتئین را تائید می کند. همچنین وسترن بلات با آنتی بادي مونوکلونال ضد پروتئین core با F پروتئین تخلیص شده و نیز پروتئین core تخلیص شده نشان داد که این آنتی بادي با core واکنش می دهد در حالیکه F پروتئین را نمی شناسد - شکل . - 2
این نتایج علاوه بر اینکه مؤید خاصیت آنتی ژنیک پروتئین است عدم واکنش متقاطع این پروتئین را نشان می دهدو به عبارتی با بکارگیري این پروتئین به عنوان ابزار تشخیصی، نه تنها خطایی از لحاظ واکنش متقاطع با پروتئین core پیش نمی آید بلکه به خوبی می تواند توسط آنتی بادي هاي اختصاصی از core متماز گردد.نتایج تست الایزا F پروتئین با سرم بیماران HCV نشان داد که از 11 نمونه ،2 نمونه core+1 مثبت هستند - حدود 18٪ - که این میزان فراوانی آنتی بادي ضد F پروتئین در مطالعه مشابهی قبلا نشان داده شده بود - . - 8اگر چه لازم است مطالعات گسترده تري با تعداد نمونه بیشتر در این زمینه انجام شود. همچنین نتایج این تست نشان می دهد که F پروتئین تولید شده قادر است پاسخ آنتی بادي علیه F پروتئین در بیماران را تشخیص دهد. اهمیت این موضوع در استفاده از این پروتئین با اهداف تشخیصی می باشد. بویژه مطالعات نشان داده اند که حضور آنتی بادي ضد این پروتئین در بیماران می تواند یک مارکر پیش بینی پاسخ به درمان ویروسی در این بیماران باشد - . - 9
