بخشی از مقاله
چکیده
ویروس موزاییک کوتولگی ذرت - Maize dwarf mosaic virus, MDMV - یکی از مهمترین و گستردهترین پوتی ویروس هاي ذرت در دنیا میباشد. بمنظور تعیین جایگاه تاکسونومیکی ویروس جدایه استان گلستان در میان پوتی ویروسهاي غلات و سایر سویههاي MDMV و خاستگاه ویروس و قرابت آن با سویههاي سایر کشورها، گیاهان ذرت و قیاق با علائم موزاییک و کوتولگی در سال زراعی 1389 از مزارع استان گلستان جمع آوري شدند.
نمونه هاي آلوده به MDMV با آنتی سرم این ویروس در آزمون الایزاي غیر مستقیم مشخص شدند. یک نمونه آلوده به MDMV انتخاب و RNA ویروسی آن استخراج گردید، سپس ناحیه 3‘ ژنوم آن با استفاده از آغازگرهاي دژنره پوتیویروسها و اختصاصیMDMV به روش RT-PCR تکثیر و همسانه سازي گردید.
ترادف استنتاجی ناحیه CP-UTR، قطعهاي به طول 1126 نوکلئوتید بود این ترادف با ترادف سایر جدایه هاي MDMV موجود در Gen Bank و نیز دیگر پوتیویروسهاي غلات مورد مقایسه قرار گرفت و درخت فیلوژنتیکی حاصل از این ترادفها به روش neighbor-joining بدست آمد. در این آنالیز فیلوژنتیکی، 43 ترادف در 6 گروه شامل SrMV ، ZeMV ، PenMV ، JGMV ، SCMV و MDMV قرار گرفتند و جدایه گلستان در کنار جدایهاي از کشور بلغارستان گروه مشترکی تشکیل دادند.
مقدمه
بیش از 40 ویروس در ذرت بیماري ایجاد میکنند، که یکی از آنها ویروس موزاییک کوتولگی ذرت - MDMV - است. این ویروس در نقاط مختلف دنیا که میزبانهاي حساس آن رشد میکند وجود دارد و موجب %80-20 کاهش محصول میشود . - 1 - در ایران، براي اولین بار پوتی ویروسی مشابه به MDMV از منطقه دشت ناز ساري گزارش شد و آن را سویه MM - maize mazandaran - نامیدند
در سال 1382 وجود MDMV در مازندران و اصفهان مورد تایید قرار گرفت . - 4 - زارع و همکاران در سال 1383 با استفاده از روشهاي سرولوژیک و ترادف نوکلئوتیدي ناحیه CP-UTR، MDMV جدا شده از ذرت و قیاق مناطق دشت ناز ساري و اصفهان را با سایر پوتیویروسهاي غلات مقایسه کردند
بر اساس مطالعات Shukla و همکاران، خصوصیات ساختاري پروتئین پوششی پوتی ویروسها مفیدترین و مناسبترین معیار براي تشخیص و طبقهبندي پوتیویروسها میباشد . - 6 - لذا در این تحقیق نیز جدایه گلستان ویروس MDMV جمع آوري شده از مزارع ذرت با استفاده از آنالیز مولکولی ناحیه CP-UTR مورد بررسی قرار گرفت و جایگاه تاکسونومی آن در میان سایر پوتیویروسهاي غلات و سایر سویههاي MDMV تعیین گردیده و خاستگاه ویروس و قرابت آن با سویههاي سایر کشورها مشخص گردید.
مواد و روشها
گیاهان ذرت و قیاق با علائم موزاییک و کوتولگی از نقاط مختلف استان گلستان جمعآوري شدند و آلودگی آنها به MDMV با استفاده از آنتی سرم این ویروس در آزمون الایزاي غیر مستقیم بررسی گردید
به منظور تعیین ترادف نوکلئوتیدي ناحیه 3‘ ژنوم MDMV جدایه گلستان ، این ویروس با تیمار کلروفرم از ذرت جداسازي و RNA ویروس با استفاده از mRNA capture kit طبق دستورالعمل سازنده استخراج گردید. نسخه برداري معکوس به روش متداول با آنزیم Mmulv و آغازگر معکوس oligodT انجام گردید.
cDNA بدست آمده از واکنش RT با واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - توسط آغاز گرهاي اختصاصی طراحی شده از روي جدایه اروپایی و آغاز گرهاي دژنره پوتی ویروس ها تکثیر شد
جدول-1 نام، ترادف، دماي اتصال و اندازه قطعه تولید شده مربوط به آغازگرهاي مورد استفاده در آزمون RT-PCR
برنامه PCR براي هر آغازگر شامل 35 چرخه با دماي واسرشته سازي اولیه 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه و سنتز نهایی در دماي 72 درجه سانتی گراد به مدت 15دقیقه انجام شد - شکل . - 1 دماي مناسب آغازگرهاي ویروس موزاییک کوتولگی ذرت مطابق جدول 1 بکار برده شد. محصول PCR بوسیله Fermentas, - Clone JET PCR Cloning Kit - Lithunia طبق دستورالعمل سازنده در پلاسمید pJET1.2 وارد و در باکتري E.coli استرین XL-Blue همسانهسازي گردید.
پلاسمیدها سپس با کیت استخراج پلاسمید - Fermentas - طبق دستورالعمل سازنده استخراج گردید و به منظور تعیین ترادف به شرکت Techdragon - هنگ کنگ - ارسال گردید، همچنین محصول PCR تعدادي از آغازگرها بوسیله PCR - Bioneer - Purification kit طبق دستورالعمل سازنده خالص سازي گردید و براي تعیین ترادف به کشور هنگ کنگ ارسال شد که تعیین ترادف با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی قطعه انجام شد.
شکل . 1 نتایج آزمون PCR در ژل آگارز %1 با استفاده ازمارکر : - Fermentas - Gene ruler DNA ladder 100
الف: راهک 1 از چپ باند حاصل از پرایمر MD1F / MDMVG-SH راهک 2مارکر، راهک 3 باند حاصل از پرایمر .MD3F / MDMVG-SH ب: راهک 1 مارکر، راهک 2 باند حاصل از پرایمر .oligo1n / oligo2n ج: راهک ا باند حاصل از پرایمر MD3F / MD1R ، راهک 2 مارکر
روش آنالیزهاي فیلوژنتیکی
پس از ادغام ترادفهاي بدست آمده از کلنیها و محصول PCR هر قطعه، ترادف استنتاجی با استفاده از نرم افزارهاي Clustal X و Editseq بدست آمد، این ترادفها با ترادف سایر جدایه هاي MDMV موجود در بانک ژن و نیز دیگر پوتی ویروسهاي غلات توسط برنامه Clustal X مورد مقایسه قرار گرفت و بوسیله نرم افزار Treeview درخت فیلوژنتیکی حاصل از همه ترادفهاي مذکور به روش neighbor-joining بدست آمد. در این آنالیزها ویروس موزاییک رگهاي گندم - Wheat - streak mosaic virus, WSMV به عنوان outgroup مورد استفاده قرار گرفت.
