بخشی از مقاله
چکیده
کیتین - GlcNAc - poly-β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine دومین بیوپلیمر فراوان در طبیعت بعد از سلولز است و جزء اصلی کوتیکول حشرات و پوسته سختپوستان است و دیواره سلولی بیشتر قارچها بعضی از جلبکها و نماتدها را تشکیل میدهد. کیتینازها یکی از آنزیمهایی هستند که نقش تجزیه کیتین نامحلول را بر عهده دارند. باکتريها کیتیناز را براي هضم کیتین تولید میکنند اصولا آنها از کیتین به عنوان منبع کربن و انرژي استفاده میکنند. در این تحقیق سعی شده است که تولید و خالصسازي این آنزیم از یکی از سویههاي بومی ایران که توانایی تولید کیتیناز را دارد صورت گیرد. بدین ترتیب که بعد از کشت اولیه باکتري آن را به محیط پیشکشت انتقال داده و بعد از یک روز باکتري به محیط تولید که تنها تفاوت آن با محیط پیشکشت در وجود گلوکز است انتقال مییابد. سنجش فعالیت آنزیم کیتیناز به کمک معرف رنگی 3 و 5 دي نیترو سالیسیلیک اسید انجام شده و در نهایت رسوبدهی پروتئینها توسط استن انجام میگیرد. از کیتیناز میتوان در کنترل بیماريهاي قارچی در گیاهان و حشرات استفاده کرد. بدین منظور در این تحقیق به بررسی اثر مهارکنندگی آنزیم نسبتا خالصسازي شده کیتیناز بر روي تعدادي از قارچهاي آفت گیاهی پرداخته شده است. نتایج نشان دادند که بعد از رسوبدهی پروتئینها با استن میزان فعالیت آنزیمی افزایش یافت. همچنین اثر مهارکنندگی - ضد قارچی - آنزیم کیتیناز بر روي چهار قارچ آفت گیاهی ثابت شد.
واژگان کلیدي: کیتین کیتیناز رسوبدهی پروتئینها فعالیت آنزیمی اثر ضدقارچی
مقدمه
کیتین - GlcNAc - poly-β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine دومین بیوپلیمر فراوان در طبیعت بعد از سلولز است و جزء اصلی کوتیکول حشرات پوسته سختپوستان است و دیواره سلولی بیشتر قارچها بعضی از جلبکها و نماتدها را تشکیل میدهد 2 - و. - 1 این پلیساکارید یک پلیمر غیرسمی غیرآلرژيزا و ضدمیکروب است. تولید کیتین و مواد تجزیه شده از آن مانند-N acetylglucosamine وchitooligosaccharides از ضایعات پوسته سختپوستان بدلیل هزینه بالا فرآیند محدود وپیچیدهاي است. از آنجاییکه کیتین تخمیر تجدیدپذیر و وسیعی از مواد اولیه منابعی مانند کربوهیدرات و نیتروژن را نشان داده آنزیمهایی که قادر به تبدیل زیستی کیتین به محصولات قابل تخمیر با وزن مولکولی پایین هستند اساساًداراي ارزش قابل توجه اقتصادي هستند. کیتینازها یکی از آنزیمهایی هستند که نقش تجزیه کیتین نامحلول را بر عهده دارند.
باکتريها کیتیناز را براي هضم کیتین تولید میکنند اصولا آنها از کیتین به عنوان منبع کربن و انرژي استفاده میکنند . - 3 - کیتیناز از خانواده آنزیمی گلایکوزیل هیدرولازها - E.C 3.2. 1.14 - بوده که هیدرولیز پیوندهاي β-1,4 را در مولکول N-acetyl-β-D-glucosamine در کیتین و کیتین دکسترین انجام میدهد. از کیتیناز میتوان در کنترل بیماريهاي قارچی در گیاهان و حشرات استفاده کرد . - 4 - در بخش کشاورزي اثرات بیولوژیکی ضد قارچی در کیتینازهاي مختلف که توسط میکروارگانیسمها تولید شدهاند بسیار حائز اهمیت است. این اثرات به هیدرولیز کیتین در دیواره سلولی قارچ مربوط میشود . - 5 - در این تحقیق سعی شده است که کیتیناز از باکتري بومی Cohnella تولید و خالص شود. این باکتري یک باکتري مقاوم به گرما است. این باکتري از خانواده Paenibacillaceae و نژاد Bacillus است. نشان داده شده است که این باکتري بعد از قرار گرفتن در انکوباتور به مدت 24 ساعت در TS وNutrient agars در دماي 25-30 درجه سانتیگراد به خوبی رشد میکند. این رشد خوب در دماي 55 درجه سانتیگراد نیز صورت میگیرد . - 6 - در ادامه اثر مهارکنندگی این آنزیم بر روي سه قارچ آفت گیاهی بررسی شده است.
مواد و روشها
محیط تولید جهت برداشت آنزیم کیتیناز شامل همه موارد فوق همانند محیط پیشکشت است با این تفاوت که گلوکز در محیط تولید حذف شد. به ازاء هر ml100 محیط تولید ml 4 ازمحیط پیشکشت که حاوي باکتري بود اضافه شد. ارلنهاي حاوي باکتري و محیط کشت تولید به مدت 72 ساعت در دماي60 درجه سانتیگراد با دورrpm160 در انکوباتور قرار داده شد.
سنجش فعالیت آنزیم کیتیناز
سنجش فالیت آنزیمی به کمک معرف رنگی 3 و 5 دي نیترو سالیسیلیک اسید انجام شد. یک واحد فعالیت آنزیمی به صورت تشکیل 1 میکرو مول N-acetylglucosamine در شرایط سنجش تعریف میشود.تهیه محلول رنگی 1gr DNS, 30gr Potassium sodium tartrate, 1.6 gr NaOH :DNS
رسوبدهی پروتئینها بوسیله استن
در این روش یک حجم از محیط کشت به سه حجم استن سرد اضافه شد و به مدت یک شبانه روز در دماي -20 نگهداري و سپس به مدت 40 دقیقه در دماي 4 درجه و rpm18000 سانتریفیوژ شد.
بررسی اثرات ضد قارچی آنزیم نسبتا خالصسازي شده براي این منظور از 3 قارچ آفت گیاهی شامل: Rhizctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Bipolaris sp., Alternaria brassicocola, Macrophomina phaseolina, Botrytis cinerea,استفاده شد. ایزولههاي قارچ را در مرکز پتريدیش در محیط PDA کشت داده و براي رشد به مدت 24 ساعت در انکوباتور 30 ◦C قرار داده شدند.
زمانی که قطر کلنی قارچها تقریبا به 2cm رسید، 4 دیسک کاغذي استریل را در فاصله 25 میلیمتري از مرکز پتريدیش و در حوالی میسیلیومهاي قارچها قرار داده و مقادیر مساوي - 50 μl - از آنزیم نسبتا خالص شده - بعد از رسوبدهی با استن - آنزیم جوشانده شده به مدت 15 دقیقه بافر 20 mM Tris- Base و محیط کشت تولید به ترتیب به دیسکهاي 1 تا 4 در شرایط استریل اضافه شد 7 - و. - 8 در مرحله بعد پتريها در دماي اتاق و دور از نور انکوبه شده تا زمانی که رشد کلنی، دیسکهاي کنترل را پوشانده و در عین حال یک هلال در اطراف دیسک حاوي آنزیم با خاصیت ضد قارچی پدید آورد که نتایج آن توضیح داده خواهد شد.
نتایج و بحث
تولید کیتیناز
بعد از سنجش فعالیت آنزیم قبل و بعد از رسوبدهی با استن مشخص شد که بعد از رسوبدهی با استن میزان کیتیناز بیشتري خالصسازي شد. این نتایج در شکل زیر مشهود است.
