بخشی از مقاله
چکیده
این مطالعه به منظور جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی باکتری های بیفیدوباکتریوم با پتانسیل پروبیوتیکی در محصولات لبنی بومی و سنتی شهرستان جیرفت انجام گرفت. 10 نمونه محصول لبنی - 3 نمونه شیر، 4 نمونه ماست و 3 نمونه دوغ - از مناطق مختلف شهرستان جیرفت جمع آوری شد. نمونه های لبنی ابتدا در محیط MRS براث غنی سازی و سپس بر روی محیط MRS-NPLN آگار کشت داده شدند. برای شناسایی اولیه باکتری های بیفیدوباکتریوم از تست های گرم، اکسیداز، کاتالاز، ایجاد لخته در شیرخشک بدون چربی و تولید گاز وجهت تایید وجود باکتری های بیفیدوباکتریوم از تست مقاومت به موپیروسین و آنزیم فروکتوز-6فسفات فسفوکتولاز - F6PPK - استفاده شد. علاوه در این تحقیق به طور همزمان با استفاده از تکنیک PCR تکثیر نواحی از ژن 16SrDNA بطول 523 جفت باز به تایید باکتری های جدا شده پرداخته شد.
در نهایت محصولات PCR پس از خالص سازی، تعیین توالی گردید. نتایج نشان داد ازمجموع 10 نمونه لبنی جمع آوری شده، 6 نمونه مثبت بدست آمد، که بر اساس تست های بیوشیمیایی و مولکولی 3 باکتری بیفیدوباکتریوم شناسایی شدند. باکتری های بیفیدوباکتریوم شناسایی شده شامل بیفیدوباکتریوم انیمالیس زیرگونه لاکتیس، بیفیدوباکتریوم لانگوم و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم بودند. یافته های حاصل از این مطالعه نشان داد که محصولات لبنی شهرستان جیرفت دارای باکتری های بیفیدوباکتریوم که یکی از مهمترین گونه های پروبیوتیکی شناخته شده است می باشند.
واژگان کلیدی: بیفیدوباکتریوم، جداسازی، شناسایی بیوشیمیایی، لبنیات محلی، .PCR
مقدمه
امروزه به دلیل استفاده روزافزون از مواد لبنی صنعتی امکان کاهش و یا حذف باکتری های پروبیوتیک وجود دارد. میکروارگانیسم های Bifidobacterium شامل نژادهای خاصی از جنس های پروبیوتیک بر اساس منشا انسانی، حیوانی و محیطی تقسیم می شوند که فقط گونه های دارای منشا انسانی برای تولید محصولات پروبیوتیک قابل مصرف هستند. بیفیدوباکتریوم ها از طریق تولید اسید لاکتیک، اسید استیک و پروپیونیک اسید و کاهش pH روده از رشد باکتری های بیماری زا جلوگیری کرده و منجر به حفظ تعادل در تعداد باکتری های فلور طبیعی روده می شوند . - Williams, 2010 - با توجه به اهمیت پوبیوتیک ها در حفظ و ارتقاء سلامت انسان جداسازی و شناسایی آنها در محصولات لبنی و به کارگیری آنها در تولید انبوه فرآورده های لبنی ضروری به نظر می رسد. جیرفت از جمله شهرهایی است که در آن ماست و دوغ در اکثر مناطق شهر به روش سنتی تهیه می شود لذا هدف از این مطالعه جداسازی و شناسایی بیفیدوباکتریوم از محصولات لبنی این شهرستان برای معرفی محصولاتی مفیدتر برای سلامتی افراد می باشد.
مواد و روشها
در این پژوهش، 10 نمونه از لبنیات محلی نقاط سردسیر - ماست، دوغ و شیر سربیژن - و گرمسیر - ماست، دوغ و شیر کهوروئیه و ابراهیم آباد - شهرستان جیرفت استفاده گردید. سویه های به کاربرده در این تحقیق شامل سویه های مثبت استاندارد بیفیدوباکتریوم شامل بیفیدوباکتریوم مینیمم، بیفیدو باکتریوم بروه، بیفیدو باکتریوم بیفیدوم، بیفیدو باکتریوم اینفنتیس، بیفیدو باکتریوم سوبتیل، بیفیدو باکتریوم آنگولاتوم، بیفیدو باکتریوم لانگوم، بیفیدو باکتریوم ترموفیلوموم و بیفیدو باکتریوم انیمالیس زیر گونه لاکتیس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به عنوان سویه استاندارد منفی و 10 محصول لبنی بومی بمی جهت بررسی وجود باکتری بیفیدوباکتریوم بود که به طور هم زمان مورد آزمون قرار گرفتند.
روش جداسازی و شناسایی باکتری بیفیدوباکتریوم
در ابتدا حدود 2 گرم از نمونه ها جهت غنی سازی به داخل محیط کشت MRS مایع تلقیح گردید و در شرایط بی هوازی و دمای37 درجه سانتیگراد به مدت 72 ساعت گرمخانه گذاری شد. بعد از طی این مدت شیشه هایی که رنگ محیط کشت آنها کدر شده بود انتخاب شد و برای مرحله بعد مورد استفاده قرار گرفت. از کشت های آزمایشگاهی بدست آمده در محیط غنی کننده MRS مایع به کمک یک لوپ استریل در سطح محیط کشت انتخابی -NLPN MRS تلقیح شد. سپس کلیه کشت ها در دمای 37 درجه سانتیگراد و شرایط بی هوازی گرمخانه گذاری گردید و پس از 72 ساعت پلیت ها جهت یافتن کلنی های مشخص و یا مشکوک به بیفیدوباکتریوم مورد بررسی قرار گرفت. آزمون های شامل رنگ آمیزی گرم، آزمایش اکسیداز، تست کاتالاز، ایجاد لخته در شیر خشک بدون چربی و تولید گاز انجام گرفت.
آزمون های تاییدی
-1 مقاومت به میوپیروسین با استفاده از محیط اختصاصی BSM کلنی های رشد کرده در محیط MRS آگار در محیط اختصاصی بیفیدوباکتریوم ها - BSM - بصورت خطی کشت داده شد. با قرار دادن دیسک های حاوی موپیروسین روی محیط ها به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شدند. پس از طی این مدت وجود یا عدم وجود هاله رشد بررسی شد.
-2تست آنزیم فروکتوز6 -فسفات فسفوکتولاز - F6PPK - مهمترین و قابل اعتمادترین آزمایش فنوتیپی برای شناسایی بیفیدوباکتریوم ها بررسی وجود آنزیم فروکتوز -6 فسفات فسفوکتولاز است. این آزمایش بر اساس روش اسکاردوی انجام شد . - Scardovi, 1984 -
آزمون های مولکولی
استخراج DNA با استفاده ازاستاندارد بین المللی 21571 انجام پذیرفت، برای تأیید وجود بیفیدوباکتریوم در نمونه های جداسازی شده، ناحیه متغیر V از 16 SrDN بطول 523 جفت باز و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی Bif164 و Bif662 منتشر شده توسط Kok در سال 1996تکثیر شد، و همچنین ناحیه متغیر V9 از 16SrDNA بطول 1350جفت باز و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی Lm3 و Lm26 منتشر شده توسط Kauffman در سال 1999تکثیر شد. پس از انجام PCR ،به منظور بررسی وجود یا عدم وجود محصول مورد نظر و ا طمینان از انجام کامل و صحیح واکنش محصول PCR با استفاده ار ژل اگارز یک درصد الکتروفورز گردید. در نهایت برای اطمینان از اختصاصی بودن آزمایش، بهترین روش تعیین توالی محصول PCR و مقایسه آن با ژنوم باکتری بیفیدو باکتریوم و سایر ژنهای موجود در بانک ژن می باشد. بدین منظور ابتدا محصول PCR خالص سازی و سپس تعیین توالی گردد. نتایج حاصل از توالی محصولات PCR نمونه های مورد آزمایش با توالی های موجود در بانک ژن با برنامه Blast مقایسه گردید. با این کار میزان تشابه نمونه های توالی شده با توالی موجود در بانک ژن مقایسه شد.
نتایج و بحث
نمونه هایی که در محیط انتخابی MRS-NLPN رشد یافتند به عنوان مثبت تلقی شدند. از 10 نمونه مورد استفاده در این پژوهش، 6 نمونه در محیط انتخابی مورد نظر رشد نشان دادند و برای شناسایی مورد استفاده قرار گرفتند. بیفیدوباکتریوم هایی که به عنوان کنترل مثبت استفاده شده بودند در این محیط رشد کردند و باکتری های لاکتوباسیلوس که به عنوان کنترل منفی استفاده شده بودند در این محیط رشد نداشتند. از نمونه های رشد کرده در محیط MRS-NLPN براث در محیط اختصاصی MRS-NLPN کشت داده شد. کلنی های رشد کرده در این محیط اختصاصی کرم رنگ تا سفید بودند. آزمایشات بیوشیمیایی نشان داد که کلنی های ایزوله شده گرم مثبت، کاتالاز و اکسیداز منفی بودند، در محیط ام آر اس براث گاز تولید نمودند، و بعد از 6-8 ساعت گرمخانه گذاری با شیر توانستند یک لخته سفت ایجاد کنند.
ایزوله هایی که معیارهای ذکر شده را نشان دادند به عنوان جنس بیفیدوباکتریوم در نظر گرفته شدند. از تست حساسیت به موپیروسین برای تشخیص گونه های لاکتوباسیلوس از بیفیدوباکتریوم استفاده شد. چون بسیاری از خواص بیوشیمیایی این دو گونه شبیه هم می باشد. بیفیدوباکتریوم ها در برابر موپیروسین مقاوم اند در حالیکه لاکتوباسیلوس هایی که به عنوان کنترل منفی استفاده شدند بسیار حساس بودند. ایزوله ها و همچنین باکتری های استفاده شده به عنوان کنترل منفی نسبت به موپیروسین مقاوم بودند. در این مطالعه از نمونه های شیر و یک نمونه ماست باکتری بیفیدوباکتریوم جداسازی شد. نمونه های دوغ هیچ گونه بیفیدوباکتریومی نشان ندادند که می
