بخشی از مقاله
چکیده:
بعد از ظهور خانواده جدیدی از بیوپلیمرهای عملکردی از جنس الیگونوکلئوتید، پی به توانایی توالی های تک زﳒﲑه ای RNA و DNA برای اﳒام عملکردهای گوناگون برده شد که یکی از توانایی هایشان در اتصال و تشخیص اختصاصی ملکوﳍای هدف گوناگون است.این توالیها به نام آپتامر توسط روش - SELEX - جداسازی شدند. آپتامرها با قدرت اتصال بالا و اختصاصی به ملکول هدف ، می توانند جایگزین خوبی برای آنتی بادی های مونوکلونال باشند. از طرفی دیگر به دلیل اینکه وجود ﲰهای قارچی به خصوص آفلاتوکسﲔ ب1 در مواد غذایی , که یکی از فاکتورهای مهم سلامت غذایی در جوامع به حساب می آید , تشخیص راحت و ارزان این ملکول دارای اﳘییت می باشد.
به ﳘﲔ منظور جداسازی آپتامر اختصاصی بر علیه ملکول آفلاتوکسﲔ ب1 از کتاﲞانه DNA ای به طول 80 نوکلئوتید و با توالی تصادفی به طول 40 نوکلئوتید در میان دو توالی ثابت جهت اتصال آغازگرها با طوﳍای 19 و21 نوکلئوتیدی جهت تکثﲑ با روش SELEX توالی های اختصاصی توسط روش کروماتوگرافی ﲤایلی ستونی در 15 مرحله پنینگ جداسازی شده و با نشاندار کردن قطعات به روش تکثﲑ آهنا با تیمیدین نشاندار , قدرت اتصال و اختصاصیت آهنا بررسی شد. روش تاییدی استفاده از قطعات نشاندار شده با رادیواکتیو میزان %41 اتصال قطعات به ستون حاوی آفلاتوکسﲔ را نشان داد. امید می رود با روشن شدن بسیاری از نقاط مبهم برای ما توسط این پژوهش راه برای استفاده از آپتامرها در زمینه های ﳐتلف ﳐصوصا تشخیص و درمان میسر شود.
مقدمه:
.از زمان اولﲔ گزارشات از تکامل تدرﳚی لیگاند با غﲏسازي تصاعدي - SELEX - توسط سه آزمایشگاه مستقل - 2 - پیشرفت جداسازي در آزمایشگاه این امکان را داد آه آپتامرهاي ﳐتلفی در مقابل ملکوﳍاي متنوع آشف شود.استفاده از آپتامرها به عنوان ابزار تشخیص در زمینه هاي ﳐتلف می تواند جایگزین مناسﱯ براي استفاده از آنﱵ بادي باشد - . - 3 آپتامرها را می توان در زمان آوتاهی تکثﲑ کرد و پس از مرحله شکل گﲑي با میل بالا به ملکول هدف متصل شوند. آپتامرها میتوانند توسط روشهاي شیمیایی تولید شوند و ملکوﳍاي آشکارساز را می توان به آهنا به طور دقیق در ﳏدودة مشخص متصل آرد. قابلیت آپتامرها براي استفاده در بسیاري از تشخیصهاي مبتﲏ بر آپتامرها از ﲨله در سنجشهاي از نوع - 4 - - ELISA - ، بیوسنسورها - آپتاسنسور - - 5 - ، آپتازﱘ ها - 6 - ، فلوسیتومﱰي - 7 - و تکنیک هاي جداسازي مانند آروماتوگراﰲ میل ترآیﱯ و الکﱰ وفورز لوله موئﲔ روشن شده است . - 8 -
تولید آیتهاي ﲡاري ارزان قیمت ﳐصوصاً براي تشخیص ﲰوم آلوده آنندة مواد غذایی مثل آفلاتوآسﲔ یکی از ایده هاي آاربردي در زمینه تشخیص خواهد بود. آپتامرها نه تنها در زمینه تشخیص بلکه در زمینه درمان و ﲥیه دارو به سرعت در حال پیشرفت هستند چنان آه آشورهاي پیشرفته اي چون آمریکا و آﳌان و چﲔ در این جهت به سرعت به ﲡربیات بیشﱰي دست یافته اند. اولﲔ بار در سال - 1960 - این ایده آه اسیدهاي نوآلئیک علاوه بر استفاده آهنا به عنوان الگو در تکثﲑ و رونویسی ، میتوانند بر اساس شکلگﲑي ساختمان سومشان عملکردهاي بیوشیمیایی نیز داشته باشند، شکل گرفت - . - 11 در سال 1990 انتخاب آزمایشگاهی براي جداسازي - RNA - هاي ﳐتلف از سکانس هاي تصادﰲاستفاده شد آه می توانستند به هدفهاي ﳐتلف متصل شوند . - 9 -
النیگتون و زوستاك - Ellington & Szostak - شکل هاي حاصله از این توالیها را آپتامر نامیدند ، در حالی آه ترك و گلد - Tuerk & Gold - رویه انتخابی توالیها را »تکامل تدرﳚی لیگاندها با غنی سازي تصاعدي - SELEX - « نامیدند - 9و. - 10 اولﲔ آپتامر متصل شونده به نوآلئوتید در سال 1993 توسط ساسانفر و زستاك - Sassanfar & Szostak - جداسازي شد. این - RNA - آپتامر متصل شونده به آدنوزین توسط ستون - ATP - آگارز جداسازي شد و استخراج ستون توسط ملکولهاي آزاد - ATP - صورت گرفت - . - 12 آپتامرهاي - RNA - اي براي بسیاری از ملکول هدف آوچک و پروتئیﲏ شامل ملکوﳍایی چون - ATP - ، - GTP - ، - B12 - مالاشیت گرین - Malachite green - و آافئﲔ ، پتپید - Rev - ویروس - HIV-1 - ، - MS2 - پروتئﲔ و ترومبﲔ 13 - و - 14 و اسیدهاي آمینه اي چون –L آرژانتﲔ - 15 - و L12– والﲔ - 16 - و تعداد معدودي از دیگر اسید آمینه ها براي بررسی ساختار و ﳓوة اتصال آپتامرها به اسیدهاي آمینه جداسازي شدند.
آپتامرهاي اختصاصی براي برخی آربوهیدراتها نیز جداسازي شدند - . - 17 اما جداسازی آپتامر برعلیه تولیدات طبیعی می تواند ارزش تشخیصی فراوانی داشته باشد. مثلاً آپتامرهاي متصل شونده به آلکالوئید تئوفیلﲔ با حساسیت و اختصاصیت بالا می تواند براي تشخیص غلظت این آلکالوئید در سرم بیماران مبتلا به آسم ، برونشیت آه ﲢت درمان با تئوفیلﲔ هستند مصرف شود. جداسازي آپتامرهاي متصل شونده به آنﱵ بیوتیک ها می تواند داراي مزیت ها و مصارﰲ چون وسیله هایی براي مطالعه و بررسی تنظیم ترﲨه به عنوان ریبوسوئیچ ها باشند - 18 - و یا در پیشرفت دادن روشهاي خالص سازي ﲤایلی از آپتامرهاي اختصاصی متصل شونده به اسﱰپتومایسﲔ براي جداسازي - RNA - هاي متصل شونده به پروتئﲔ استفاده آردند. - 19 -
اولﲔ مطالعات براي بررسی میانکنش آپتامرها با پروتئﲔ به منظور مهار عملکرد پروتئﲔ هاي بیماري زا در سال 1990 اﳒام شد آه در آن بر علیه پروتئﲔ هایی آه دخیل در رونویسی و تکثﲑ ژهناي ویروس - HIV - بودند - RNA - آپتامر جداسازي شد . - 20 - از زمان آشف آپک - Aspergillus flavus - در غذاي حیوانات در آشور انگلستان تا آنون مطالعات زیادي روي آفلاتوآسﲔ صورت گرفته و مشخص گردیده آه آفلاتوآسین ها متابولیت هاي ثانویه دو گونه آسپرژیلوس فلاووس - Aspergillus flavus - و آسپزریلوس پارازیتیکوس است. - 1 - آفلاتوآسﲔها ﲰی ، موتاژنیک و سرطان زا هستند - . - 1 بیشﱰین مطالعات بر روي آفلاتوآسﲔ ها معطوف به - AFB1 - شد زیرا قویﱰین و فعال ترین زیر گروه این دسته می باشد. - 1 - البته با توجه به ضرورت اندازه گیری آفلاتوکسین ب1 تا به حال از کیتهای مبتنی بر آپتامر برای اندازه گیری آن استفاده نشده است.
سم آفلاتوآسﲔ در آشورهاي پیشرفته از طریق روشهایی چون الیزا - ELISA - و آروماتوگراﰲ مایع با ظرفیت بالا - HPLC - سنجیده می شود این روشها هر چند دقیق و حساس می باشند وﱄ به ﳊاظ پر هزینه بودن مواد ﲞصوص در جهان سوم مقرون به صرفه ﳕی باشد. روشهاي شیمیایی دیگري چون فلورسنس آبی براي آفلاتوآسﲔ
ب1 و تغیﲑ رنگ آشکار در معرض ﲞار آمونیم هیدروآسید نیز استفاده می شود آه دقت روشهاي قبل را ندارند. - - 1 در ساﳍاي اخﲑ استفاده از ملکوﳍائی بنام آپتامر در روشهاي تشخیص پیشرفت چشمگﲑي داشته و ﳏققﲔ توانسته اند از این ابزار براي شناسائی بسیاري از ملکوﳍا استفادهآنند.
مواد و روشها:
آتاﲞانه الیگونوآلئوتیدي به طول 80 نوآلئوتید آه در دو طرف دو تواﱄ مشخص براي پراﳝر و در وسط یک توالی به طول 40 نوآلئوتید به طور تصادﰲ قرار دارند با تنوع عملاً حدود 1015 زﳒﲑة متفاوت به روش شیمیایی سنتز شده و برای تکثیر در هر مرحله پنینگ ، پراﳝر فوروارد به طول 21 نوآلئوتید با توالی 5'- CAT CCA TGG GAA TTC GTC GAC -3' آه جایگاههاي آنزﳝی - Nco1 - و - - Sall و - EcoR1 - براي آلونینگ را دارد و پراﳝر رویورس به طول 19 نوآلئوتید با توالی 5'- CTG CCT AGG CTC GAG CTCG -3' آه جایگاههاي آنزﳝی - Sac1 - و - Xho1 - و - - SHo1 براي آلونینگ را دارد، طراحی شدند.صحت قطعات روی ژل پلی اکریل امید تایید شد.تکثیر قطعات با روش PCR و استفاده از کیت سینازن اﳒام شد.برنامه تکثیر در دستگاه Biorun با دمای اولیه 95 به مدت 5 دقیقه و دمای دناتوراسیون 94 به مدت 30 ثانیه و دمای اتصال 62 به مدت 30 ثانیه و دمای تکثیر 72 درجه به مدت 30 ثانیه اﳒام شد.
قطعات پس از تکثیرتوسط اتانول ﲣلیص شده و پس از تعیین غلظت در بافر اتصال PBS/MgCl2 برای غربالگری روی ستون افلاتوکسین- BSA متصل به ژل سفارز برده شد و با بافر شستشو ﳘان بافر اتصال حاوی - Tween 20 - قطعات متصل نشده خارج شده و آپتامرهای متصل شده با بافر الوشن از ستون خارج شده و ﳎددا ﲣلیص شدند و برای مرحله بعدی تکثیر شدند. پس از 15 بار تکرار غربالگری اختصاصیت آپتامرهای جدا شده با نشاندار کردن آهنا با تیمیدین نشاندار با رادیوا کتیو سنجیده شد. نیمی از قطعات تکثیر شده روی ستون غیر اختصاصی فاقد AFB1 برده شد و نیمی دیگر روی ستون اختصاصی حاوی AFB1 برده شد. ستون با بافر شستشو حاوی - Tween 20 - % 0.3 شسته شد و میزان تشعشع ﳏصول شستشو با دستگاه بتا کانﱰ اندازه گیری شد.
نتایج و ﲝث:
تکثیر صحیح قطعات مطابق شکل با ژل آگارز و روش الکﱰفورز تایید شد.میزان رادیواکتیویته قطعات خارج شده از هر دو ستون در جدول ارائه شده است.
