بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی گونههاي حیوانی استفاده شده در پودر ماهی به لحاظ اقتصادي و بهداشتی بسیار حائز اهمیت می باشد. هدف از این تحقیق تشخیص وجود تقلب و شناسایی گونههاي استفاده شده - نشخوارکنندگان، طیور و خوك سانان - در پودر ماهی با استفاده از روشهاي مبتنی بر واکنش زنجیره اي پلیمراز بود. بدین منظور از پودر ماهی تولید کارخانه هاي مختلف تعداد 20 نمونه جمع آوري شد. استخراج DNA از نمونهها به روش گوانیدین تیوسیانات- سیلیکاژل صورت گرفت.
قطعات 104، 183 و 290 جفت بازي به ترتیب براي نشخوار کنندگان - گاو، گوسفند و بز - ، طیور - مرغ و بوقلمون - و خوك سانان - اهلی و وحشی - از نواحی ژنی 12s rRNA و 16s rRNA، DNA میتوکندري با استفاده از واکنش زنجیره اي پلیمراز به صورت Multiplex و آغازگر هاي اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوك سانان تکثیر شد. نتایج نشان دادند که نمونههاي پودر ماهی جمع آوري شده هیچگونه آلودگی به بقایاي بافتی خوك سانان نداشتند. اما 75 درصد نمونههاي جمع آوري شده آلودگی به بقایاي بافتی نشخوارکنندگان و 55 درصد آلودگی به بقایاي بافتی طیور را نشان دادند. همچنین میزان آلودگی مشترك بقایاي بافتی نشخوار کنندگان و طیور در پودر ماهی 45 درصد برآورد شد.
مقدمه
تولید کنندگان و پرورش دهندگان نیاز به اطلاعات شفاف و دقیق جهت خرید مواد خوراکی براي تغذیه دام و طیور خود دارند.
تشخیص گونهها در محصولات غذایی با استفاده از ژنهاي مخصوص بکارگیري روش PCR در سالهاي اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفت. بیماريهایی چون جنون گاوي و آنفولانزاي مرغی، سوء استفاده بعضی تولیدکنندگان مواد غذایی، دلایل مذهبی، حساسیتها - آلرژيهاي - غذایی و غذاهاي ترانس ژنتیک 1 - GMOs - باعث افزایش نگرانی مردم در خصوص ترکیبات محصولات غذایی شده است
گاهی اوقات برچسب محصولات غذایی تضمین کافی و درستی را از ترکیب واقعی خوراکها نمیدهند، لذا لازم است روشهایی براي تعیین و تصدیق ترکیبات خوراك وجود داشته باشد تا همه از مصرف کنندگان و هم تولید کنندگان در برابر تعویض و تقلیات غیر قانونی حمایت گردد. تشخیص اختصاصی گونه ها و شناسایی گروههاي حیوانی از قبیل نشخوار کنندگان - جهت حفظ سلامت عمومی و جلوگیري از گسترش بیماریهاي - TSE بر اساس تقسیم بندي قوانین اتحادیه اروپا جهت آزمون سالم بودن تولیدات پروتئینی حیوانی در مواد غذایی و خوراك دام و طیور استفاده می شود . - 5 - از جمله مزیتهاي روش PCR نسبت به سایر روش ها می توان دقت و سرعت زیاد، حساسیت بالا و انعطاف پذیري این روش نسبت به سایر روشها اشاره کرد
براي نخستین بار چیکونی - 1994 - 1 از روش PCR جهت شناسایی تقلب در گوشت و فرآورده هاي گوشتی جانوران اهلی استفاده نمود . - 3 - سپس در سال 1998 یک آزمایش PCR با توان شناسایی بافت نشخوار کنندگان در خوراك دام و طیور - 2 - MBM ابداع گردید
دالماسو و همکاران - 2004 - با طراحی آغازگرهاي اختصاصی از نواحی متفاوت DNA میتوکندري 12s rRNA - و - 16s rRNA جهت تشخیص تقلب در خوراك حیوانات چهار دسته از حیوانات 3 - گونه نشخوار کننده، 2 گونه پرندگان، خوك سانان و 12 گونه ماهی - را شناسایی نمودند. نتایج نشان از اعمال تقلب در مواد خوراکی تولید شده داشت
هدف اصلی از این تحقیق توسعه و بهینه نمودن Multiplex PCR از نواحی ژنی 12s rRNA و 16s rRNA براي تشخیص اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوك سانان در پودر ماهی بود. به کمک این روش نیز می توان گونه هاي حیوانی استفاده شده در سایر مواد خوراکی را نیز از یکدیگر متمایز نمود.
مواد و روشها
پس از هموژن نمودن نمونه ها با ازت مایع، خارج نمودن روغن و چربی از پودر ماهی با استفاده از متانول- کلروفورم و آب با نسبت - 2 :1 : 0/8 - انجام شد. استخراج DNA از نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات – سلیکاژل - بوم3 و همکاران - 1990 صورت گرفت.
کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از روش نورسنجی4 تعیین شد. واکنش زنجیره اي پلیمراز به صورت Multiplex با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی - - 4 نشخوار کنندگان - F: 5" GAA AGG ACA AGA GAA ATA AGG 3" و - R : 5 " TAG GCC CTT TTC TAG GGC A 3"، طیور F: 5 T GA GAA CTA CGA GCA CAA AC 3" - و - R: 5" GGG CTA TTG AGC TCA CTG TT 3" و خوك سانان - F: 5" CTA CAT AAG AAT ATC CAC CAC A 3" و - R: 5" ACA TTG TGG GAT CTT CTA GGT 3" به ترتیب براي تکثیر قطعات 104، 183 و 290 جفت بازي از نواحی ژنی 12s rRNA و 16s rRNA، DNA میتوکندري به منظور بررسی آلودگی احتمالی نمونه هاي پودر ماهی به گونه هاي فوق، توسط دستگاه ترموسایکلر - T personal, Biometra, Germany - بر اساس روش استاندارد انجام شد.
اجزاي واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر و غلظت نهایی مواد به صورت زیر بود:
100، 1/5 U آنزیم Taq پلیمراز، 0/1 میلی گرم بر میلی لیتر BSA، 0/4 mM از هر dNTP، 2/5 mM از MgCl2، 20، 20 و 5 پیکامول به ترتیب از آغازگرهاي نشخوارکنندگان، طیور و خوك سانان و 200 نانوگرم از DNA هدف که با استفاده از برنامه حرارتی زیر و در 35 سیکل تکثیر شدند: 94 درجه سانتی گراد براي 10 دقیقه، 94 درجه سانتی گراد براي 30 ثانیه، 60 درجه سانتی گراد براي 50 ثانیه، 72 درجه سانتی گراد براي 1 دقیقه و 72 درجه سانتی گراد براي 10 دقیقه. محصولات PCR بر روي ژل آگارز %2 به مدت 60 دقیقه و با ولتاژ 90 ولت الکتروفورز شده و ژل پس از رنگ آمیزي توسط اتیدیوم بروماید براي بررسی محصولات توسط اشعه ماوراي بنفش بررسی شد.
نتایج و بحث
نتایج نورسنجی نشان داد که DNA هاي استخراج شده از کیفیت مناسبی براي انجام PCR برخوردار هستند. الگوي باندي مربوط به کنترل مثبت استفاده شده در این آزمایش تأیید کننده اختصاصی بودن باندهاي حاصل از آغازگرهاي اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوك سانان است. از طرفی عدم مشاهده باند در کنترل منفی نشان دهنده دقت و صحت نتایج آزمایش است. در الکتروفورز ژل آگارز محصولات PCR با آغازگرهاي اختصاصی خوك سانان در نمونه هاي مورد آزمایش هیچگونه باندي مشاهده نشد
می توان نتیجه گرفت که در هیچ یک از نمونه هاي مورد استفاده در این آزمایش، قطعه اي تولید نگردیده است می توان نتیجه گرفت که هیچ یک از نمونه هاي مورد آزمایش، به بافت خوك سانان آلوده نبودند. اما در مجموع در 15 نمونه پودر ماهی آلودگی به بقایاي بافتی نشخوارکنندگان و 11 نمونه پودر ماهی آلودگی به بقایی بافتی طیور مشاهده گردید که در شکل-1 مشخص گردیده است.
همچنین تعداد 9 نمونه از پودرهاي ماهی جمع آوري شده آلودگی مشترك به بقایاي بافتی نشخوارکنندگان و طیور را نشان دادند. سه ناحیه DNA ژنومی، DNA میتوکندریایی و RNA به عنوان نشانگرهایی بالقوه براي توالی هاي DNA، امکان شناسایی و تمایز بین گونه ها را ممکن کرده اند
از آنجاییکه DNA میتوکندریایی و RNA نسخه هاي زیادي به ازاي هر سلول دارند، مولکول هاي مناسبی براي آزمونهاي تشخیصی با روش PCR می باشند
نتایج حاصله نشان دهنده ضرورت گنجاندن آزمون هاي مبتنی بر PCR در استاندارد ملی ایران براي افزایش کیفیت خوراك پروتئینی دام و طیور است. که براي این منظور روش Multiplex که در این تحقیق استفاده و بهینه شد می تواند جهت کنترل سایر مواد غذایی به لحاظ بررسی تقلب مورد استفاده قرار گیرد.
شکل--1 الکتروفورز محصولات .Multiplex PCR شماره DNA - 1 گاو - ، شماره DNA - 2 مرغ - ، شماره DNA - 3 خوك - ، M Multiplex PCR، C- کنترل منفی، شماره 4 - 16 - نمونه هاي پودر ماهی - ، M100 نشانگر وزنی مورد استفاده براي تعیین اندازه محصولات .PCR اندازه باندهاي نشانگر وزنی از بالا به پایین برحسب bp به قرار زیر می باشد
