بخشی از مقاله
نسل جدید توالی یابی DNA
روش تعیین توالی سنگر (Sanger) با فراهم کردن ابزاري براي رمزگشایی ژنوم، زیست شناسی را به فضاي جدیدي وارد کرد. هدف رمزگشایی ژنوم انسان نیاز به توسعه روشهاي توالییابی DNA را افزایش داد و روشهاي جدیدي چون الکتروفورزمویین (capillary) توسعه یافت. اتوماسیون آزمایشگاهی و فرایند موازيسازي باعث ایجاد شرکتهایی شد که مراکز توالییابی نام گرفتند و صدها دستگاه توالی یابی DNA را شامل میشدند. روش تعیین توالی اتوماتیک سنگر نزدیک به دو دهه غالب بود و موجب انجام تعدادي توالی یابی تاریخی همچون توالی یابی ژنوم انسان شد. علیرغم بهبود تکنیکی در این مدت، محدودیتهاي این روش نیاز به فناوريهاي جدید را نشان می داد. این روشهاي جدید، نسل بعدي توالییابی Next Generation ) NGS (Sequencing نام گرفتند. فناوريهاي جدید متشکل از استراتژيهاي مختلفی هستند که بر ترکیبی از روشهاي تهیه الگو (template)، توالییابی، تصویربرداري و انطباق توالی((alignment و سرهمسازي((assembly تکیه دارند. حضور این فناوريها در بازار، تصورات ما در تحقیقات علوم پایه، کاربردي و بالینی را تغییر داده است. پیشرفت اساسی ایجاد شده بوسیله NGS، توانایی تولید حجم بسیار زیادي از دادهها با قیمت بسیار ارزان است ( در بعضی موارد یک میلیارد قطعه کوتاه در هر اجرا در یک دستگاه در یک روز). این ویژگی قلمرو جدیدي را براي آزمایشها فراهم کرده است. براي مثال در مطالعات بیان ژنها، این روشها جایگزین روش ریزآرایه (microarray) میشوند که میتوانند نسخههاي نادر را بدون نیاز به اطلاعات قبلی از یک ژن خاص تشخیص دهند. توانایی توالی یابی کل ژنوم بسیاري از موجودات خویشاوند، امکان مقایسه در سطح ژنوم و مطالعات تکاملی را فراهم کرده که تا چند سال قبل قابل تصور نبود. مهمترین کاربرد NGS میتواند توالییابی مجدد ژنوم انسانی باشد که درك ما از تفاوتهاي ژنتیکی انسانها و نقش آن در بسیاري از موارد از جمله بیماريهاي ژنتیکی را افزایش میدهد.
اولین نشانهها از آنچه که میتوانست انقلاب در توالییابی باشد در سال 2005 با فناوري توالییابی بوسیله سنتز( Sequence by (Synthesis و پروتکل مولتیپلکس پلونی (Multiplex polony) ظاهر شد که هر دو از استراتژيهایی استفاده میکردند که به میزان بسیار زیادي حجم واکنشهاي لازم را همراه با افزایش تعداد واکنشهاي توالییابی کاهش میداد. روش توالییابی بوسیله سنتز که از pyrosequencing استفاده میکرد قطعاتی با طول 250bp را تعیین توالی میکرد ( در مقایسه با قطعات با طول 750bp در روش سنگر). گذشته از طول قطعات، تعداد قطعات توالییابی شده در یک اجرا با یک هزینه معین نیز فاکتور مهمی است. در حال حاضر سه فناوري توالییابی نسل جدید در دسترس هستند: Roche’s (454) GS FLX Genome Analyzer از شرکت Roche Applied Sciences ، 1G sequencer Illumina’s Solexa و سیستم SOLiD از .Applied Biosystem
فناوريهاي جدید متشکل از روشهاي مختلفی هستند که شامل تهیه الگو، توالییابی و آنالیز دادهها است. ترکیبی از پروتکلهاي اختصاصی، یک فناوري را از فناوري دیگر متمایز می سازد و نوع داده تولید شده را تعیین میکند. در تهیه الگو از یک مولکول
DNA منفرد یا از الگوهاي تکثیر شده بصورت کلون از یک مولکول منفرد استفاده میشود. توالییابی بوسیله سنتز با عناوین
cyclic reversible termination(CRT) ، single-nucleotide addition (SNA) و Real Time sequencing (RTS) طبقهبندي می شوند. Sequencing by Ligation(SBL) نگرش دیگري است که در آن DNA ligase جایگزین DNA polymerase میشود. روشهاي تصویربرداري جفتشده با این استراتژيهاي توالییابی شامل اندازهگیري بیولومینسانس تا تصویربرداري چهاررنگ یک واکنش مولکولی منفرد می شود. دادههاي انبوه تولید شده نیاز به فناوري اطلاعات براي ذخیرهسازي و ردیابی را ضروري می سازد.
تهیه الگو
روشهاي فعلی عموما DNA ژنومی را بصورت تصادفی به اندازههاي کوچک برش میدهند که از آنها قطعات الگو یا الگوهاي جفتی انتهایی ( (Pair-end بدست میآید. موضوع مشترك در فناوريهاي NGS این است که قطعات متصل یا ثابت شده به یک سطح جامد هستند. تثبیت الگوها در مکانهاي جداگانه بر روي سطح اجازه میدهد که صدها تا میلیونها واکنش توالییابی بصورت همزمان انجام شود. اکثر سیستمهاي تصویربرداري براي تشخیص یک اتفاق منفرد فلورسانس طراحی نشدهاند بنابراین به الگوهاي تکثیرشده نیاز است. دو روش عمومی emulsion PCR و solid phase PCR استفاده میشوند (شکل (1
شکل 1
توالییابی و تصویربرداري
روش توالییابی CRT بصورت چرخهاي از خاتمه دهندههاي (terminators) برگشتپذیر است که شامل واردشدن نوکلئوتید، تصویربرداري فلورسانس و برش است. در مرحله اول یک DNA polymerase به الگو متصل شده و یک نوکلئوتید فلورسانس اضافه میکند. پس از آن نوکلئوتیدهاي اضافه برداشته میشوند. سپس تصویربرداري انجام میود تا نوکلئوتید وارد شده تشخیص مرحلهداده شودبعدي. شکست است که در آن گروه بازدارنده واکنش و رنگ فلورساس برداشته و پس از شستشو چرخه بعدي
انجام میشود. در روش SNA از pyrosequencing استفاده میشود که آزاد شدن پیروفسفات غیرآلی را با تبدیل آن به نور مرئی اندازهگیري میکند. پس از وارد شدن dNTP مکمل، DNA polymerase پرایمر را گسترش داده و متوقف میشود و پس از اضافه شدن dNTP مکمل بعدي سنتز DNA دوباره شروع میشود. ترتیب و شدت نور ثبت شده، توالی را مشخص میکند. SBL نیز روشی چرخهاي است که از DNA ligase و پروبهاي کدکننده یک باز یا کدکننده دو باز استفاده میکند. به بیان ساده یک پروب نشاندار شده فلورسانس با توالی مکمل در مجاورت پرایمر هیبرید می شود. سپس DNA ligase براي
