بخشی از مقاله
چکیده
میزان بیان کم ژنهاي خارجی در گیاهان ترانسژنیک فاکتور مهم محدود کننده در مهندسی ژنتیک گیاهان میباشد. به علت فعالیت تنظیمی در نسخهبرداري ژنها، راهاندازها به طور گسترده در سیستم ترانسژنیک گیاهی مورد استفاده قرار گرفته است. استفاده از راهاندازهاي قوي همچون راهانداز ویروس موزائیک کلم و یوبی کوئیتین1 ذرت، در تحقیقات بیوتکنولوژي گیاهی بسیار رایج بوده اما گاهی سطح بیان ژنهاي هدف در کلیه بافتهابه صورت هدر رفت انرژي گیاه محسوب شده و این امر اصلاً رضایت بخش نیست. استفاده از راهانداز قوي مخصوص بذر، باعث بیان ژنها در بذور شده و چنین مشکلاتی را در بر ندارد.
هدف از این تحقیق جداسازي راهانداز اختصاصی ژن -D هوردئین بذور جو رایج در کشور میباشد. به این منظور از گیاهک رقم رایج آلجر استخراج ژنوم صورت گرفت. با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی طراحی شده تکثیر بخش راهانداز ژن -D هوردئین عملی گردید. قطعه تکثیر یافته در به وکتور pGEMT متصل شده و سپس باکتري E. coli ترانسفورم گردید. در نهایت براي تایید نهایی، قطعات کلون شده پلاسمیدهاي نوترکیب براي توالییابی فرستاده شدند. نتایج حاصله توسط نرم افزار BLAST و Clustal w با توالیهاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی مقایسه شدند. راهانداز -D هوردئین ژنوتیپ آلجر در 98 درصد مناطق داراي 97 در صد شباهت نوکلئوتیدي بود. همچنین نتایج نشان داد که راهانداز -D هوردئین با راهانداز HMW گندم بسیار مشابه هستند.
کلمات کلیدي: راهانداز، ترانسژنیک، -D هوردئین، آلجر، E. coli
مقدمه
پرولامینها گروهی از پروتئینهاي ذخیرهاي گیاهی هستند که غنی از 2 اسیدآمینه بنامهاي پرولین و گلوتامین میباشند. پرولامینها در غلات به میزان زیادي یافت میشوند. پرولامین هر یک از غلات نام بخصوصی دارد. بطوریکه در گندم گلیادین، در جو هوردئین1، در چاودار سکالین2 و در ذرت زئین3 میباشد . - 4 - پروتئینهاي اصلی ذخیرهاي جو پرولامینها هستند که اصطلاحاً هوردئین نامیده میشوند و حدود %35-50 کل نیتروژن دانه را تشکیل میدهند . - 7 - هوردئینها در چهار گروه یا خانواده پلیپپتیدي قرار میگیرند که هوردئینهاي A، B، C وD نامیده میشوند. -B هوردئین حدود%70-90 با وزن مولکولی 46-35 کیلو دالتون، -Cهوردئین حدود %10-30 با وزن مولکولی 75-55 کیلودالتون، -γ هوردئین% 1-2 با وزن مولکولی کمتر از 20کیلودالتون، -D هوردئین حدود %2-4 با وزن مولکولی بیش از 100کیلودالتون و -A هوردئین حدود %5 از پرولامینها را تشکیل میدهند - -D . - 8
هوردئین توسط لوکوس Hor3 روي بازوي بلند کروموزوم شماره 5 و هوردئینهاي A، B و C به ترتیب توسط مکانهاي ژنی Hor5، Hor3 و Hor1 که روي بازوي کوتاه کروموزوم شماره 5 قرار دارند، کنترل می شوند . - 9 - مقایسه توالی هوردئین با پلیپپتیدهاي گلوبولین و گلوتنین گندم نشان داد که با -D هوردئینها همساخت هستند. راهاندازها اولین مرحله بیان ژن - اتصال آنزیم RNA پلیمراز به - DNA را کنترل کرده، مقدار و سرعت ساخته شدن mRNA را مشخص میکند. بنابراین بیان ژن به ویژگی ذاتی راهانداز مربوطه بستگی دارد . استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتور4 براي تولید پروتئینهاي نوترکیب از 20 سال پیش مورد توجه دانشمندان کشاورزي مولکولی5 قرار گرفته است . - 3 - در کشاورزي مولکولی تولید آنزیمهاي نوترکیب، پروتئینهاي داروئی و دیگر متابولیتهاي ثانویه در گیاهان مد نظر است. از مزایاي استفاده از گیاهان براي تولید پروتئینها میتوان به تولید محصول در مقیاس زیاد و هزینههاي کم تولید نسبت به تولید در باکتريها، مخمرها و یا سیستم سلولهاي پستانداران اشاره کرد .
در این میان بذر گیاهان براي تولید پروتئین نوترکیب بسیار مناسب می باشند که با توجه به شکل تجمعی آن ، جمعآوري و پردازش پروتئین حاصل به سهولت انجام میگیرد . - 1 - یکی از راهکارهاي مناسب قرار دادن ژن مورد نظر تحت راهانداز یک ژن مخصوص بذر میباشد. راهاندازهاي قوي همچون راهانداز ویروس موزائیک کلم و یوبی کوئیتین1 ذرت، در تحقیقات بیوتکنولوژي گیاهی بسیار استفاده شده است، اما سطح بیان ژنهاي هدف در بافتها اغلب رضایت بخش نیست. زیرا افزایش بیان ژنهاي خارجی در بیشتر بافتها باعث اثرات زیانبار در گیاه میزبان میشود. ولی استفاده از راهانداز قوي مخصوص بذر و آندوسپرم، باعث بیان ژنها در بذور شده و چنین مشکلاتی را ندارد. با توجه به مواردفوق تحقیق حاضر به منظور جداسازي راهاندازهاي اختصاصی ژن -D هوردئین بذور جو رایج در کشور صورت میگیرد.
مواد و روشها
از بذر جو رقم آلجر، باکتري E. coli سویه DH5α موجود در آزمایشگاه مهندسی ژنتیک استفاده شد. وکتور کلونینگ pGEMT-Easy از شرکت Promega، آنزیمTag DNA polymerase از شرکت زیست فناوري کوثر، کیت استخراج از ژل و کیت استخراج پلاسمید از شرکت Bioneer کره جنوبی و آنزیمهاي برشی از شرکت Fermentas تهیه گردیدند. محیط هاي LB مایع و LB آگار و آنتیبیوتیک آمپیسیلین در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت. بذور این گیاه پس از شستشو در گلدانهاي پلاستیکی در گلخانه کشت گردیده و بعد از دو هفته از برگهاي جوان گیاه استخراج DNA ژنومی به روش CTAB صورت گرفت . - 6 - به منظور تکثیر راهانداز ژن -D هوردئین از گیاه جو، از توالی این ژن با نواحی بالادستی موجود که قبلاًشناسایی شده و در بانک بینالمللی ژن - NCBI - موجود است - Gene ID:671536 - ، استفاده شده و طراحی پرایمر براياین ناحیه صورت گرفت.
در این پژوهش به منظور هدایت پروتئینهاي سنتز شده توسط ژن انتخابی به واکوئل و تجمع آنها درواکوئل آندوسپرم بذر، توالی مربوط به پپتید نشانه نیز منظور شده است. به منظور اتصال قطعات تکثیر یافته به وکتورهاي مورد هدف، توالیهاي شناسایی دو آنزیم برشی HindIII و NcoI به ترتیب به انتهاي 5´ آغازگرهاي رفت و برگشت اضافه گردید.5´ATAAGCTTCTTCGAGTGCCCGCCGATTTG -3´ پرایمر رفت5´- AACCATGGCAGCGGTGGTGAGAGCCAC-3´ پرایمر برگشت تکثیر DNA با استفاده از دستگاه ترموسایکلر و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده انجام گردید. جهت تخلیص محصول PCR از کیت تخلیص Bioneer استفاده گردید. اتصال محصول PCR به pGEMT-Easy با قرار دادن مخلوط آنها در 4 درجه به مدت 24 ساعت صورت گردید. باکتري E. coli مستعد شده بوسیله محصول واکنش اتصال ترانسفورم گردید. از کلونیهاي سفید تشکیل شده به عنوان باکتریهاي ترانسفورم شده استخراج پلاسمید صورت گرفت.
نتایج و بحث
جهت جداسازي ناحیه راهانداز از واکنش زنجیرهاي پلیمراز استفاده گردید. با استفاده از گرادیانت PCR دماي اتصال مناسب آغازگرها 63 درجه سانتیگراد تشخیص داده شد - شکل. - 1 بعد از الکتروفورز محصول PCR در روي ژل آگارز 1 درصد، قطعه مورد نظر از ژل بریده و با استفاده از کیت تخلیص شد. در مرحله بعد با استفاده از روش TSS براي انتقال ناقل به باکتري، محصول اتصال به باکتري E. coli سویه DH5α منتقل شده - 2 - و در محیط LB آگار داراي آمپیسیلین، X.gal و IPTG پخش گردید. بعد از 16 ساعت استخراج پلاسمید از کلونیهاي سفید با استفاده از کیت صورت گرفت. براي تایید فطعه کلون شده، از PCR کلونیهاي سفید - شکل - 2، PCR پلاسمیدهاي استخراج شده - شکل - 3، و برش وکتور کلون شده با دو آنزیم برشی NcoI و HindIII استفاده شد.
به دلیل وجود سایت برشی NcoI در داخل توالی مورد استفاده در طراحی پرایمر برش با دو آنزیم NcoI و HindIII ایجاد دو قطعه تقریبی 300 و 200 نوکلئوتیدي نمود - شکل. - 4 بعد از توالییابی صحت قطعه مورد نظر تایید گردید. شکل 5 توالی قطعه تکثیر شده را نشان میدهد. بلاست توالی بدست آمده نشان داد که بخش راهانداز این ژن در 100 درصد مناطق، داراي %99 شباهت نوکلئوتیدي با بخش بالادست ژن Hor3، - 10 - Hordeum vulgare، و در 99 درصد مناطق، داراي %86 شباهت نوکلئوتیدي با بخش راهانداز HMW، - 5 - Triticum aestivum میباشد. بنابراین ناحیه راهانداز -D هوردئین جو داراي تشابه زیادي با ناحیه راهانداز HMW گندم میباشد
. تفاوتهاي موجود را میتوان به جهشهاي رخ داده در این بخش از ژن -D هوردئین که سبب اختلاف ارقام جو براي این قسمت از ژنوم شدهاند نسبت داد. نتایج نشان داد که ناحیه پپتید نشانه این توالی با ناحیه پپتید نشانه ژن -Dهوردئین Hordeum Vulgare در 87 درصد مناطق، داراي %100 شباهت آمینواسیدي میباشد. بعد از اطمینان از صحت توالی، این توالی براي بررسی میزان بیان به وکتور بیانی مناسب منتقل گردید.
