بخشی از مقاله
چکیده:
تنش خشکی مهم ترین محدودیت براي کشاورزي در سراسر جهان است. صدها ژن در گیاهان در پاسخ به تنش رطوبتی القاء می شوند. شناسایی و بررسی ویژگیهاي ژنهاي تنظیم کنندهي کلیدي دخیل در تحمل به خشکی اهمیت فوق العادهاي در بهبود ژنتیکی گیاهان دارد. این پژوهش به منظور جداسازي و همسانه سازي ژن MYC2، که تصور می شود در ایجاد تحمل به خشکی نقشی بر عهده دارد، از یک رقم متحمل به خشکی کلزا - Brassica napus - و بررسی تغییرات بیان آن در پاسخ به تنش خشکی انجام شد. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده از ژن MYC2 در آرابیدوپسیس، یک قطعه cDNA به طول 962 جفت باز از ژن BnMYC2 از رقم Karun جداسازي، همسانه سازي و توالی یابی شد. این قطعه همانندي بالایی را با ژن MYC2 آرابیدوپسیس نشان داد. بررسی بیان ژن BnMYC2 افزایش بیان آن را در پاسخ به تنش خشکی نشان داد. بیشترین بیان BnMYC2 در رقم 36 Karun ساعت بعد از تنش و نزدیک به شش برابر میزان بیان در حالت عدم وجود تنش بود. این نتیجه بر این موضوع دلالت میکند که شاید این ژن در تحمل به خشکی دخیل باشد.
واژه هاي کلیدي: ژن MYC2، تنش رطوبتی، بررسی بیان ژن
مقدمه
خشکی یکی از تهدیدهاي مهم تولید گیاهان زراعی در بسیاري ازنقاط جهان است. گیاهان به تنش خشکی واکنش نشان می دهند و سیگنال هاي هدایت شده، سبب بیان تعداد بیشماري ژن هاي مرتبط به تحمل تنش خشکی می شوند . - 6 - با مطالعه ژنوم گیاهان بخشی از اطلاعات در ارتباط با دریافت سیگنال خشکی، انتقال آن و نیز برخی ژنهاي القا شونده توسط این تنش شناخته شده است. ژن هایی که در پاسخ به تنش خشکی فعالیت می کنند را می توان به دو گروه کلی ژن هاي رمز کننده ي پروتئین هاي کارکردي و ژن هاي رمز کننده ي پروتئین هاي تنظیمی، از جمله عوامل رونویسی، تقسیم بندي کرد. پروتئینهاي 1bHLH خانوادهي بزرگی از عوامل رونویسی متصل شونده به 2DNA در جانوران وگیاهان میباشند. یکی از اعضاي این خانواده، عوامل رونویسی MYC هستند . - 9 - این عوامل در فعال سازي ژن هاي دفاعی القاء شونده توسط مسیر علامت دهی جاسمونیک اسید - JA - و آبسیزیک اسید - ABA - ، به همراه عامل رو نویسی دیگري به نام MYB، نقش کلیدي بازي می کنند و تاثیر گذاري آنها در ایجاد تحمل به تنش هاي محیطی خصوصا تنش خشکی و شوري به اثبات رسیده است . - 4 - ژن - At1g32640 - AtMYC2 یک ژن هسته اي بدون اینترون و واقع بر کروموزوم شماره 1 آرابیدوپسیس می باشد که پروتئینی با 623 اسید آمینه را کد می نماید . - 5 -
این ژن به همراه عامل رونویسی دیگري به نام AtMYB2 به عناصر سیس به نام هاي 3MYCR و 4MYBR در پروموتور ژن RD22 متصل میشوند و بیان ژن RD22 رادر تنش خشکی و شوري تنظیم می کنند. RD22 ژنی است در آرابیدوپسیس که واکنش دهنده به کم آبی است و القاي آن به واسطه ي آبسیزیک اسید صورت می گیرد . - 2 - ژن AtMYC2 در بافتهاي برگ، ریشه، ساقه و گل بیان می شود. گیاهان تراریخته اي که افزایش بیان AtMYC2 و AtMYB2 را دارند حساسیت بالاتري به اسید آبسزیک نشان می دهند و بیان ژن هاي القا شونده توسط آبسزیک اسید همچون RD22 در این گیاهان تراریخت افزایش یافته است . - 8 - دربسیاري ازمناطق دنیا یکی از مشکلات توسعه کشت کلزا - Brassica napus - تنش هاي محیطی و از جمله تنش خشکی است . - 3 - از این رو تولید گیاهان متحمل به تنش ضروري به نظر می رسد. یک راه حل بالقوه در این راستا، طراحی گیاهانی بر پایهي یافتههاي مولکولی مربوط به کارکرد ژنها و بر اساس شبکههاي تنظیمی درگیر در تحمل به تنش، تکامل و رشد گیاهان است. اولین قدم در این مسیر شناسایی ژن هاي کلیدي موثر در تحمل خشکی است. این پژوهش به منظور جداسازي ارتولوگ ژن MYC2 از یک رقم متحمل به خشکی کلزا و بررسی تغییرات بیان آن در پاسخ به تنش خشکی پس از شناسایی ارقام متحمل و حساس به خشکی کلزا طی بررسی هاي مزرعه اي انجام شد.
مواد و روش ها
پس از شناسایی رقم متحمل به خشکی - - Karun بذر این رقم در گلدان و در شرایط گلخانه در خاك استریل کاشته شد. گلدانها پس از رسیدن گیاهان به مرحلهي دوبرگی در اتاقک رشد با طول روز 16 ساعت و دماي 24 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. با توجه به شباهت زیاد نواحی اگزونی ژن هاي آرابیدوپسیس و کلزا، آغازگرهاي اختصاصی جهت جداسازي ژن MYC2 از کلزا - BnMYC2 - با توجه به ترادف ژن AtMYC2 و با استفاده از نرم افزار CLCbio طراحی شد. استخراج RNA از رقم متحمل با استفاده از کیت RNX Plus طبق دستورالعمل مربوطه انجام شد. براي ساخت cDNA از First Strand cDNA Syntesis شرکت Fermentas و براي همسانه سازي محصول PCR از پلاسمید pTZ57R/T استفاده شد. پلاسمید استخراج شده به منظور تعیین ترادف با استفاده از آغازگرهاي همگانی M13Forwad و M13Reverse تعیین ترادف شد. ترادف هاي به دست آمده با ترادفهاي موجود در GenBank مقایسه شدند و صحت آنها تایید گردید.
تنش خشکی در مرحلهي سه برگی شدن بوتهها اعمال شد. نمونه گیري از بافت برگ در زمانهاي 20 و40 دقیقه، 1، 2، 3، 6، 9، 12، 24 و 48 ساعت بعد از اعمال تنش انجام شد. استخراج RNA از نمونههاي گیاهی تحت تنش با استفاده از کیت RNXplus انجام گرفت. پس از تعیین کیفیت و کمیت RNA استخراج شده سنتز cDNA انجام شد. میزان مساوي از RNA براي همه نمونه ها وارد سنتز cDNA شد. به منظور بررسی بیان ژن یک آغازگر آنتی سنس جدید به همراه آغازگر سنس که در مرحلهي جداسازي استفاده شده بود به کار گرفته شد و فرآیند PCR با استفاده از آنها انجام شد. همچنین آغازگرهایی از ژن اکتین کلزا به عنوان ژن کنترل داخلی براي تصحیح بررسی تغییرات بیان ژن BnMYC2 طراحی شدند. بعد از اتمام واکنش PCR، الکتروفورز ژل آگارز در شرایط یکسان براي تمام نمونهها انجام شد. تصویر ژل با برنامه TOTAL LAB کمی و نمودارهاي مربوطه با برنامه Excel رسم گردید.
نتایج وبحث
با انجام واکنش PCR وجود ژن مورد نظر در گیاه کلزا مورد ارزیابی قرار گرفت. الکتروفورز محصول PCR نشان داد که قطعه cDNA جداسازي شده از کلزا یک قطعه به طول حدود 1000 جفت باز بود که با توجه به فاصله آغازگرها در ژن 939 - AtMYC2 جفت باز - قابل انتظار بود. پس از همسانه سازي و هضم آنزیمی قطعه مورد نظر در پلاسمیدهاي نوترکیب آزاد شد - شکل . - 1 سپس ترادف قطعه همسانه سازي شده به طول 962 جفت نوکلئوتید بدست آورده شد. پس ازتعیین ترادف قطعهي جداسازي شده، جستجوي BLASTN در سایت NCBI - www.ncbi.nlm.nih.gov - نشان داد که ترادف مورد نظر با e-value صفر و درصد همانندي بسیار بالا 99-100 - درصد - با توالی هاي cds مربوط به MYC در Brassica oleracea و MYC2 در Arabidopesis thaliana همخوانی دارد که نشان دهنده صحت جداسازي و همانند سازي است - جدول . - 1 بررسی بیوانفورماتیک پروتئین مربوط به قطعه جداسازي شده ژن BnMYC2 نشان داد که این قسمت از پروتئین BnMYC2 دربرگیرنده ي 320 آمینواسید می باشد و شباهت بسیار بالایی با نواحی متناظر خود در پروتئین AtMYC2 دارد.
پلاسمید
قطعهي آزاد شده پس از هضم آنزیمی
در این تحقیق تغییرات بیان ژن BnMYC2 در رقم متحمل Karun در پاسخ به تنش خشکی بررسی شد. یک قطعه cDNA به طول 236 bp از ژن موردنظر در شرایط بدون تنش و در نمونه گیري هاي متعدد بعد از تنش تکثیر شد. نتایج نشان داد که بالاترین سطح بیان ژن 36 BnMYC2 ساعت بعد از اعمال تنش رخ داده است. روند تغییر سطح بیان طی زمانهاي صفر تا 48 ساعت سیر صعودي نشان داد. - شکل2 و. - 3 میزان بیان ژن در رقم Karun در 36 ساعت بعد از اعمال تنش نزدیک به شش برابر میزان بیان در حالت عدم وجود تنش بود. شاید بتوان افزایش بیان این ژن در شرایط تنش را نشانه اي از دخالت آن در ایجاد تحمل به تنش خشکی قلمداد کرد. اگر چه تکرار آزمایش براي بررسی دقیق تر تغییرات بیان ژن BnMYC2 ضروري است.
شکل .2 بررسی بیان ژن BnMYC2 در شرایط تنش خشکی. ردیف بالا باند کنترل داخلی مربوط به ژن اکتین و ردیف پایین باندهاي مربوط به ژن BnMYC2 است. چاهکها به ترتیب: - 1نشانگر - ، 2 - کنترل منفی - ، 0 - 3 ساعت تنش - ، 40 - 4 دقیقه تنش - ، 20 - 5 دقیقه تنش - ، 1 - 6 ساعت تنش - ، 2 - 7 ساعت تنش - ، 3 - 8 ساعت تنش - ، 6 - 9 ساعت تنش - ، 9 - 10 ساعت تنش - ، 12 - 11 ساعت تنش - ، 18 - 12 ساعت تنش - ، 24 - 13 ساعت تنش - ، 36 - 14 ساعت تنش - ، 48 - 15 ساعت تنش - .
