بخشی از مقاله
چکیده
بهبود کیفیت تخمیر سیلاژ بر اساس فرایند تخمیر طبیعی لاکتیک اسید است. LABهای متحمل به نمک سبب بهبود و کیفیت تخمیر علوفه میشوند. و از رشد باکتریهای مضر جلوگیری میکند. باکتریهای خاک به ویژه جنس لاکتوباسیلوس طیف گستردهای از مواد ضدمیکروبی و فعال را تولید می کند. هدف از این مطالعه جداسازی و خالص سازی LAB های متحمل به نمک موجود در خاک، و بررسی میزان رشدشان در غلظتهای مختلف نمک است. در ابتدا برای جداسازی LAB از خاک از روش غنی سازی در محیط MRS Broth و کشت در محیط MRS جامد و سپس قرار دادن پتریها در جار بیهوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 تا 72 ساعت است. باکتریهای اسید لاکتیک نمونههای خاک توسط روشهای فنوتیپی - رنگ آمیزی گرم، تستهای بیوشیمیایی - جداسازی و تخلیص گردید سپس میزان مقاومت این باکتریها را در برابر غلظت های %10-%1 نمک ارزیابی شد. طبق نتایج بدست آمده از این آزمایش 20 باکتری لاکتیک اسید جداسازی شد که همه این ایزولهها در غلظت نمک %1 ، % 2/5 و %5 رشد کردند.
واژه های کلیدی: باکتری مولد لاکتیک اسید، تخمیر غیر هوازی، کیفیت سیلاژ، تحمل به نمک، جداسازی
مقدمه
در سالهای اخیر، توجه محققان به شناسایی LAB از منابع گوناگون جلب شده است. لاکتوباسیلها عبارتند از باکتر یهای میلهای گرم مثبت که در مواد گیاهی و جانوری مانند: شیر، دوغ، پنیر و ماست یافت میشوند با این حال مطالعاتی بر روی بقایای خاک انجام شده است که به خوبی حضور لاکتیک اسید باکتری را در خاک نشان داده است. خاک منبع غنی از کربوهیدرات ترکیبات نیتروژنی و دیگر مواد که برای رشد لاکتیک اسید ضروری است را دارا میباشد. لاکتوباسیلها یکی ازعمده ترین باکتریها با توان پروبیوتیکی به شمار می آیند که از رشد دیگر میکروارگانیسمها جلوگیری میکنند . - Wadher & etal 2010 - توان ضدمیکروبی پروبیوتیکها، به منظور کاهش میکروارگانیسمهای بیماریزا حائز اهمیت میباشد . - Lindgren and Dobrogosz 1990 - لاکتوباسیلها با تولید ترکیباتی نظیر باکتریوسین دارای اثر آنتاگونیستی بر طیف وسیعی از باکتریها هستند . - Vuyst and Leroy 2007 -
این گونه ترکیبات ممکن است متابولیسم باکتریهای پاتوژن یا سموم آنها را نیز تحت تأثیر قراردهند . - Mack & etal 1999 - تاکنون مطالعات بسیاری در مورد جداسازی و شناسایی گونههای مختلف لاکتوباسیل از شیر و فرآوردههای سنتی وهمچنین ریزوسفر خاک گزارش شده است - Dave . - and Shah, 1997 همچنین تحقیقات وسیع جهت استفاده از باکتریهای اسیدلاکتیک و ترکیبات ضدمیکروبی تولید شده توسط این باکتریها مبنی بر اثرات سودمند آنها در صنایع غذایی انجام گرفته است . - Ziemer and Gibson 1998 - حفاظت از علوفه مرطوب مزرعه که سیلاژ نام دارند بر اساس فرایند تخمیر طبیعی لاکتیک اسید است. باکتریهای مولد لاکتیک اسید کربوهیدرات محلول در آب را طی فرایند انبار - ensiling - به اسیدهای آلی تبدیل میکنند.
در نتیجه PH کاهش مییابد و سیلاژ محافظت میشود . - McDonald etal 1991 - به طور کلی حضور LAB در سیلو ها قابل ملاحظه نیست - Lin etal 1992 and Cai etal . - 1994 وقتی LAB موفق به تولید اسید لاکتیک کافی در طول تخمیر به منظور کاهش PH و مانع از رشد باکتری های تولید کننده اسید بوتریک - BAB - مثل کلستریدیا میشود، منجر به کیفیت پایین سیلاژ میشود - McDonald etal 1991 - ، بنابراین لازم است از برخی مواد افزودنی برای کنترل میکروب ها در طی تخمیر سیلو ها استفاده شود که نمک یکی از مواد افزودنی مهم برای حفظ مواد غذایی است. نمک طعام - NaCl - رشد باکتریهای مضر را مهار و باعث افزایش تخمیر مطلوب میشود - NaCl . - Masui etal 1979 مانع رشد و فعالیت پروتئولیتیک BAB میشود، ولی بر روی LAB تاثیر ندارد و فرض بر این است که LABهای متحمل به نمک سبب بهبود و کیفیت تخمیر علوفه میشود.
با این حال مطالعات زیادی مزایای مثبت استفاده از باکتریها - LAB - به عنوان مواد افزودنی سیلاژ گزارش داده اند - Hellinges etal 1985 and Cai & kumai 1994 and sharp etal 1994 - باکتریهای اسید لاکتیک باکتریهای گرم مثبت، بدون حرکت، بدون اسپور وکاتالاز منفی، به شکل باسیل یا کوکسی هستند که قندهای مختلف را به لاکتات و استات تبدیل میکنند - Askarian & etal 2008 and Azizpour & etal 2009 and Cai & etal 1999 - and Karger & Basel, 2008 باکتریهای اسید لاکتیک عموما ایمن میباشند وممکن است علیه باکتریهای پاتوژن خاصیت آنتاگونیستیک داشته باشند . - Cai & etal 1999 - خاک مخلوط نسبتا پیچیده ای از مواد معدنی جامد، آب، هوا و جانداران و فرآوردههای آنها میباشد.
لایه فوقانی خاک از لحاظ حضورجانداران حائز اهمیت میباشد. بافت فیزیکی، ترکیب شیمیایی، منشا، عمق و حاصلخیزی این لایه فوق العاده متفاوت است. خاک یکی از مخازن عمده میکروبها محسوب میشود. خاک به طور طبیعی زیستگاه گروه وسیعی از باکتریها است که منشاء محصولات بیواکتیو با فعالیتهای فارماکولوژیک متنوع هستند، این ترکیبات به طور وسیع به عنوان مواد دارویی و شیمیایی در پزشکی، دامپزشکی و کشاورزی استفاده میشوند. باکتریهای خاک به ویژه جنس لاکتوباسیلوس طیف گستردهای از مواد ضدمیکروبی و فعال را تولید میکند - . - Gohel & etal 2006 and NAKAYAMA, & YANOSHI, 1967
مواد و روش:
-1تهیه و جمع آوری نمونه ها:
از عمق 10 تا 15 سانتی متری خاک مزارع برنج و باغات مرکبات استان مازندران نمونه برداری انجام شد. نمونه ها در ظروف استریل قرار داده شده و پس از انتقال به آزمایشگاه در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد.
-2غنی سازی:
همه نمونهها پس از انتقال به آزمایشگاه برای جداسازی باکتری مولد لاکتیک اسید از روش enrichment که توسط Chen و همکاران در سال 2005 توضیح داده شد استفاده شد. به این صورت که 1 گرم از هر نمونه خاک را در محیط MRS مایع به مدت3-2 روز روی شیکر قرار داده پس از غنی سازی هر نمونه خاک، رقتهای10-1 تا 10-7 از هر ارلن تهیه شده و مقدار 100 میکرولیتر از رقتهای -4 10 تا 10-7در پلیت حاوی MRS جامد کشت داده و به مدت 72-48 ساعت در جار بیهوازی در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوباته شد. - . - Cisem 2003 and chen & etal 2005
-3جداسازی:
پس از پایان زمان انکوباسیون، پلیتها از جار خارج شده و بر اساس مشاهدات مورفولوژیک، کلونیهایی که از نظر رنگ، شفافیت، شکل و اندازه با هم متفاوت بوده انتخاب و سپس به صورت کلنی تک در پلیتهای جدید کشت خطی داده شدند . - Cisem 2003 - انجام این کار در بررسی LAB جهت افزایش خلوص و همچنین فعال شدن ایزولهها ضروری است.
-4شناسایی:
برای شناسایی لاکتیک اسید باکتریها از تست های بیوشیمیایی کاتلاز و گرم استفاده شد - . - Sharpe 1979 and charteris et al 2001 ایزولههای کاتالاز منفی و گرم مثبت انتخاب شدند. نگهداری کوتاه مدت ایزولهها روی محیط کشت MRS جامد انجام شد. برای
