بخشی از مقاله
چکیده
میگروارگانیسمها از جمله موجودات ریز میکروسکوپی هستند که نقش بسیار مهمی در کاهش آلایندهها دارند. چنین فرایندي را اصطلاحا پاكسازي زیستی می نامند . در میان میکروارگانیسم هاي مختلف، باکتریها بدلیل تخمیر و دهالوژنه کردن ترکیبات آلی آلوده کننده به ترکیبات کمضررتر از اهمیت بیشتري برخوردار هستند. در تحقیق حاضر تلاش شده تا وجود چنین باکتريهایی را در دریاچه گوريگول بررسی نموده و سپس قابلیت تجزیهکنندگی نفتالین توسط آنها مورد بررسی قرار گیرد. جهت نیل به این منظور از نواحی که داراي بیشترین آلودگی بودند، نمونهبرداري گردید. نمونههاي بدست آمده را در محیطهاي اختصاصی که نفتالین تنها منبع کربن آنها بود کشت داده و مطالعات اولیه فنوتیپی، بیوشیمیائی و ژنتیکی بر اساس ژن16S rRNA انجام گردید. نتایج آزمایشات نشان داد که باکتريهاي جدا شده قابلیت تجزیهکنندگی ترکیبات آروماتیک حلقوي - PAHs - را دارا میباشند.
باکتريهاي شاخص در این تحقیق متعلق به جنس Bacillus sp. و گونه B. pumilus با ضریب خویشاوندي %99/9 و جنس.Shewanella sp و گونه Sh. xiamenensis با ضریب خویشاوندي %99/1 میباشند. جدایه S7d1M در این تحقیق به عنوان یک استرین جدید از باکتريهاي تجزیهکننده پشنهاد شد و ترادف ژن16S rRNA آن در سایت GenBank/EMBL با کد اختصاصی GQ988720 ثبت گردید. در این تحقیق همچنین مشخص گردید که ایزوله هاي جدا شده از جنس.Bacillus sp در غلظت NaCl %5 حداکثر تجزیه کنندگی PAHs را دارا میباشند درحالیکه اپتیمم تجزیه در ایزولههاي جدا شده از جنس Shewanella sp. غلظت NaCl %1/5 است
کلمات کلیدي: نفتالین، ژن 16S rRNA، دریاچه گوريگول، Bacillus sp.، .Shewanella sp.
مقدمه
ترکیبات آروماتیک حلقوي به واسطه داشتن حلقههاي بنزنی جزء ترکیبات پایدار به حساب میآید و به دلیل آسیبهاي مهمی که به پستانداران وارد میکنند، از اهمیت خاصی برخوردار بوده در واقع یکی از ترکیبات سمی، سرطانزا و موتاژن به حساب می آید . - 8 - از تحقیقات انجام شده در پدیده اصلاح زیستی میتوان به جداسازي Bacillus cereus از محیطهاي واجد نفتالین و قابلیت رشد آنها در حضور نفتالین توسط آلکین و همکاران در سال - 1 - 1998 و تعیین هویت سویههاي از باکتريهاي جنس Paenibacillus و Pseudomonas با قابلیت تجزیه نفتالین توسط پیهپی و همکاران در سال 2009 اشاره کرد . - 7 - هدف از این تحقیق مطالعه وجود باکتریهاي تجزیهکننده نفتالین از دریاچه گوريگول واقع در مناطق کوهستانی آذربایجانشرقی بوده است که به علت قرار گرفتن در مسیر ترانزیت بینشهري و بین المللی در معرض آلایندههاي مختلف قرار دارد.
مواد و روشها
نمونههاي مورد نظر از دریاچه گوريگول واقع در آذربایجانشرقی تهیه شدند. در مجموع 12 نمونه از چهار منطقه و از عمق 25 سانتیمتري تهیه و به آزمایشگاه منتقل گردیدند . جهت جداسازي میکروارگانیسمهاي تجزیهکننده نفتالین، از محیط کشت ONR7a حاوي نفتالین به عنوان تنها منبع کربن و انرژي استفاده گردید . - 3 - نمونههاي آب دریاچه به نسبت 1:10، به وسیله محیط مایع و استریل رقیقسازي و به مدت نیم ساعت تکان داده و سپس 100 میکرولیتر از نمونههاي رقیق شده بر روي محیط کشت ONR7a داراي نفتالین بصورت سطحی کشت شدند.
در گام بعدي کلنیها در محیط Marine broth - Difgo 2216 - خالصسازي شده و سپس تستهاي اولیه بیوشیمیائی از جمله رنگآمیزي گرم، بررسی خصوصیات فنوتیپی، کاتالاز، اکسیداز، تولید اندول، قابلیت تولید اسید از قند و احیاء نیترات انجام گردید - . - 6 نمونهها در فریزر-70˚C و در محیط Marine broth - Difgo 2216 - که داراي 30% گلسیرول بود نگهداري گردیدند. براي تعیین بهترین غلظت - NaCl - جهت تجزیه بهینه نفتالین، از محیط کشت مایع ONR7a با غلظتهاي مختلف NaCl استفاده گردید. یک فلاکس بدون تلقیح نیز به عنوان شاهد تهیه گردید. در نهایت تمامی فلاکسها در دماي 25 درجه سانتی گراد و 100 دور در دقیقه تکان داده شدند . - 5 - اندازهگیري جذب در 480 نانومتر و به صورت روزانه انجام و یادداشت گردید. این کار تا 10 روز بعد از تلقیح انجام گرفت.
براي بررسی ژنتیکی جدایه ها، DNAي آنها توسط روش کوربین و همکاران با اندکی تغییر استخراج گردید - - 2 و ترادف ژنهاي 16S rRNA بوسیله واکنشهاي PCR با کمک پرایمرهاي اختصاصی - 4 - انجام شدند و محصولات PCR بعد از خالص سازي با استفاده از Roche kit - Germany - براي تعیین هویت به کمپانی Maccrogene - Korea - ارسال گردیدند. ترادف هاي بدستآمده بوسیله نرمافزار multiple sequence alignment program CLUSTAL X - version1.83 - مرتب گردیده - 10 - و درخت فیلوژنتیکی مربوطه بهوسیله نرمافزار افزارMEGA version 4 رسم شد - . - 9
نتایج و بحث
نتایج حاصل از تکثیر و ترادف ژن 16S rRNA جدایه ها و مقایسه آنها با بانک اطلاعاتی NCBI و EZTaxon.org نشان داد باکتريهایی که قادر به تجزیه ترکیبات آروماتیک حلقوي - PAHs - هستند بالاي %99 شباهت با جنس Bucillus sp. دارند ومتعلق به گونه B. pumilus به صورت دو جدایه تحت نامهاي S2d1M و S6d1M و جنس Shewanella sp. و گونه Sh. xiamenensis با ضریب خویشاوندي %99 به صورت دو جدایه S7d1M و S8d1M میباشند. همچنین جدایه S7d1M در این تحقیق به عنوان یک استرین جدید از باکتريهاي تجزیه کننده پشنهاد شد و ترادف ژن 16S rRNA آن در GenBank/EMBL با کد اختصاصی GQ988720 ثبت گردید - شکل. - 1 همچنین نتایج آزمایشات نشان داد که باکتريهاي جدا شده قابلیت تجزیهکنندگی ترکیبات آروماتیک حلقوي - PAHs - را دارا میباشند. به عبارت دیگر ساختار شیمیایی نفتالین بکار رفته تحت تیمار باکتريها، شکسته شده و به مواد سادهتر تجزیه گردید. به منظور کسب اطمینان از شکسته شدن مواد حاصل، تیمارها را با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج UV/visible بررسی و اختلاف پیکها ثبت گردید - نمودار. - 1
نمودار 1 نمونهاي از پیکهاي ثبت شده توسط جدایه S7d1M، پیک: A محیطONR 7a واجد نفتالین و جدایه S7d1M و پیک:B محیط ONR 7a واجد نفتالین بدون تلقیح باکتري مذکورمی باشد. در بررسی میزان تجزیه ترکیبات PAHs در طول موج 480 نانومتر مشخص شد که میزان تجزیه نفتالین در باکتريهاي متعلق به جنس Bucillus sp. و گونه B. pumilus از غلظت 1 تا 5 درصد با افزایش میزان نمک افزایش یافته و در غلظت 5 درصد نمک قادر است PAHs را به صورت بهینه تجزیه کند و در محیطهاي بالاتر از 5 درصد نمک، میزان اثر تجزیهکنندگی کاهش می یابد - شکل 2الف - در حالیکه میزان تجزیه نفتالین در باکتريهاي متعلق به جنس Shewanella sp. و گونه Sh. Xiamenensis از غلظت صفر تا 1/5 درصد نمک افزایش یافته و در غلظت 1/5 درصد نمک قادر است PAHs را به صورت بهینه تجزیه کند. نتایج حاصل از اندازهگیري جذب در 480 نانومتر نشان داد که در تمام غلظتهاي نمک، میزان تجزیه به مرور زمان بیشتر از روزهاي دیگر میشود - شکل 2ب - و این به علت سازگار شدن میگروارگانیسمها با غلظت نمک و افزایش تولید آنزیمهاي لازم براي تجزیه و افزایش میزان رشد و فعالیت باکتريها با گذشت زمان است.
باکتريهاي جدا شده در این تحقیق از عمق 25 سانتیمتري دریاچه جداسازي شدند. چون در این قسمت حداکثر میزان اکسیژن جهت فعالیت باکتریهاي هوازي و بیهوازي اختیاري فراهم است اگر چه باکتريهاي مورد مطالعه قابلیت رشد در دماي 10-30˚C و دامنه PH قلیائی 6-9 را دارا هستند، ولیکن رشد بهینه در دماي 28˚C با PH = 7/5 میباشد. آزمایش هاي بیوشیمیائی نشان میدهد که S6d1M قادر به تولید آنزیمهاي اکسیداز، کاتالاز، لیپاز و پروتئاز بوده، اما قادر به تولید آنزیمهاي آمیلاز، کیتیناز، DNase و Pullulanase نمیباشد. این جدایهها قادر به تولید اسید از قندهاي: L Arabinose، D-Mannos، D-Glucose، D-Fructose، D-X ylose وSorbitol میباشد. همچنین احیاء نیترات به نیتریت توسط این باکتري ها در فاز اول صورت میگیرد. مطابق با آزمایشات مذکورمشخص گردید که جدایه S7d1M قادر به تولید آنزیمهاي اکسیداز، کاتالاز، آمیلاز و لیپاز بوده ولی قادر به تولید آنزیمهاي کیتیناز، پروتئاز، DNase و Polunoase نمی باشد. همچنین این جدایه
