بخشی از مقاله
چکیده
اسطوخودوس گیاهیدارویی و معطر متعلق به خانواده نعناع است.ترکیبات فراری که در ماده مؤثره اسطوخودوس بیشترین اهمیت را دارند به میزان زیادی از محیطی که گیاه در آن توسعه یافته تأثیر میپذیرند.در این تحقیق تکنیک cDNA-AFLP برای شناسایی برخی از ژن های افتراقی پاسخ دهنده به تنش شوری در گیاه اسطوخودوس به کار گرفته شد.اسطوخودوس در بستر پرلیت کوکوپیت - 2:2 - در سه تکرار کشت گردید. تیمار شوری با غلظتهای صفر، 22 و 25 میلیموالر از NaCl اعمال شد.
نمونهبرداری برای استخراج RNA با استفاده از روش بیوزول صورت گرفت. پس از استخراج RNA کل،mRNA تخلیص شد. از روی mRNA جدا شده رشته اول و دوم cDNA ساخته شد. cDNAدو رشتهای با استفاده از آنزیمهای TaqI و PstIمورد هضم قرار گرفت و پس از اتصال آداپتور به آنها قطعات تکثیر شدند.پس ازجداسازی باندهای دارای بیان افتراقی از روی ژل اکریالمید،در باکتری E.Coli همسانه سازی و سپس توالی یابی شدند. با استفاده از نرم افزار BlastXتعیین خصوصیت ژن ها صورت گرفت. ژنهای جداسازی شده در گروههاییشامل ژنهای انتقال سیگنال، ژنهای پاسخ دفاعی و ژنهای سوخت و ساز سلولی تقسیمبندی شدند.
مقدمه
اخیرا گیاهان دارویی توجه زیادی را در زمینههای مختلف مانند صنعت مواد غذایی، صنعت دارویی وتولید مواد معطر و آرایشی به خود معطوف ساخته است .]3[ رویکرد روز افزون استفاده از گیاهان دارویی و فراورده های حاصله از آن، نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی پررنگتر کرده است .]8[ اسطوخودوس فرانسوی2 گیاهی است مدیترانهای که متعلق به خانواده نعناع می باشد. اسطوخودوس یکی از گیاهان ارزشمند و مهم است و خواص زیادی به آن نسبت داده شده است.
بهترین دارو برای رفع خستگی و تنشهای حاصل از کار روزانه و تأمین آرامش اعصاب بوده و مسکن و خوابآور است. اما مهمترین خواص آن ضد افسردگی، ضد پریشانی، تشنج و رفع دردهای عصبی است .]25[ اسانس اسطوخودوس بیش از 05 نوع ترکیب مختلف دارد که مهمترین آن عبارتند از: لینالیل استات، سینئول، لینالول .]22[ تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان دارویی به میزان زیاد تحت تاثیر عوامل محیطی قررار مریگیررد .]7 [ یکری از عوامرل محیطی غیر زنده موثر بر گیاهان دارویی، شوری است.
]2[ شوری یکی از مهمترین عوامل محیطی محردود کننرده تولیردات کشاورزی در بسیاری از مناطق جهان می باشد.]2[ همچنین یکی از فاکتورهای مهم محدودکننده رشد و بهرره وری در گیراه است وتقریباً برروی همه جنبههای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه تأ ثیر میگذارد .]9[برا اسرتفاده از نشرانگرهرای مولکرولی میتوان ژنهای درگیر در مقاومت به شوری را در گیاهان شناسایی کرد و با گزینش ژنوتیپهای مقاوم به اصالح و توسعه ایرن گیاهرران در منرراطق شررور اقرردام کرررد.
cDNA-AFLPیکرری از روشهررای افتراقرری شناسررایی ترروالیهررای رمررز کننررده در دو جمعیتmRNA می باشد. با استفاده از این روش امکان جستجوی چندشکلی در طول قطعات برشی در سطح cDNA میسرر می گردد .]22[ از روش cDNA-AFLPبرای آشکارسازی الگوی بیان مجموعه رونوشتهای یک بافت خاص، واکنش به ترنش یا مرحله تکاملی معیناستفاده زیادی میشود.با این روش درصد زیادی از ژنهای بیان شده، شناسایی میشوند .]6[
تنش شوری در گیاه ارزن ایتالیاییبا استفاده از روش cDNA-AFLPتوسط جایارمن و همکاران - 2558 - مورد بررسی قرار گرفت. الگوی بیان ژنی در شرایط مساعد و شرایط تنش شوری مقایسه شده و از بین 65 قطعه رونوشت بدسرت آمرده - TDF - متفاوت، تعداد 89 باند در همه سطوح شوری تظاهر داشتند. با استفاده از این تکنیک برخری از ژنهرای درگیرر در متابولیسرم، نقل و انتقال سلولی، تنظیمات رونویسی،پردازش mRNA و ذخیره مواد غذایی در شرایط تنش، شناسایی شد.
سکی و همکاران - - 2552 الگوی بیان برخی ژن های گیاه آرابیدوپسیس را در پاسخ به تنش شوری شدیددر سطح رونوشت برداری با استفاده از فناوری ریز آرایه بررسی نمودند. نتایج نشانگرآن بودکه ژنهایی که در اثر تنش در گیاه القا می گردنرد، برر اساس عملکرد محصوالت به دو گروه عمدهپروتئین های عملکردی مانند پروتئین های غشایی و آنزیمهای کلیدی برای سرنتز اسموالیتها و پروتئین های تنظیم کننده مانند عوامل رونویسی و عناصر دخیل در انتقال سیگنالتقسیم بندی میگردند.
مواد و روش
بذور سرما دهی شده اسطوخودوس در شرایط گلخانه در داخل گلدان کشت شردند. بعرد از مرحلره 0 برگری، گیاهران بره محیط کشت هیدروپونیک با محلول غذایی هوگلند منتقل شدند - شکل شماره. - 2 بعد از اطمینان از استقرار کامل نشاءها تنش شوری در سه سطح صفر،22 و 25 میلی موالر NaCl در سه تکرار اعمال گشت. گیاهان بره مردت 5 مراه برا محلرول نمکرین آبیاری شدند و به محض اینکه وارد فاز گلدهی شدند نمونه برداری از اندامهای گل و برگ صورت گرفت.
استخراج RNAاز بافتهای کوبیده شده گیاه با روش بیوزولصورت گرفت. بعد از استخراج، کیفیت و کمیت RNA توسرط روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تائید گردید. ازRNAکرل برا اسرتفاده ازکیرت mRNA captureخرالص سرازی mRNAانجام شد. رشته اول cDNA از روی mRNAتوسط آنزیم رونوشرت برردار معکروس سراخته شردو سرنتز رشرته دوم cDNA نیز بااستفاده از آنزیم DNA پلیمراز از روی رشته اولcDNAتکمیرل گردیرد. توسرط آنرزیمهرایPstI وTaqIهضرم آنزیمی درcDNAصورت گرفت.
سپس در مرحله اتصال با استفاده از آنزیم لیگاز آداپتورها به انتهای قطعات هضم شده متصل شدند تا cDNA برای تکثیر پیش انتخابی آماده شود. بعد از انجام تکثیر با آغرازگرهرای عمرومی، cDNA هرا برا آغازگرهرای اختصاصی و بصورت اختصاصی تکثیر شدند. محصوالت PCR روی ژل غیر واسرشت توسط دستگاه الکتروفورز عمرودی برا ژل اسکن corbett2000 بار گذاری شدند تا آغازگرهای مطلوب انتخاب شوند.
برای انتخاب باندهای مطلوب از الکتروفورز عمرودی باژل واسرشت پلی آکریل آمید%2 استفاده شد و باندهایی که دارای الگوی بیان افتراقی مناسب بودند بعد از رنرگآمیرزی برا نیترات نقره شناسایی و از روی ژل جدا شدند - شکل شماره. - 2 بعد از تکثیر مجدد این باندها با آغازگرهای اختصاصری خرود و بارگذاری روی ژل آگارز 2/2درصد باندهای مطلوب برای همسرانه سرازی تائیدشرد.بعرد از انجرام همسرانه سرازی در براکتری E.Coli - شکلهای شماره 3و - 0 با استفاده ازکیت کلون جت و توالی یابی آنها، ژنها برا نررم افزارهرای بیوانفورماتیرک مرورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
نتیجه و بحث
ژنهای توالی یابی شده با نرم افزارهای بیوانفورماتیکBioEdit،BlastXوMultalineبررسی شد.به طور کلی ایرن ژنهرا در سه گروه ژنی ژنهای انتقال سیگنال، ژنهای سوخت و ساز سلولی و ژنهای پاسخ دفاعی طبقه بندی شدند. از مهمترین این ژنها سیتوکروم 2P450 و کالمودولین باندینگ پروتئین2 را میتوان نام برد. سریتوکروم P450 بره فررم-های مختلفی در گیاه حضور دارد و وظیفه کاتالیز مسیر اکسیداسیون ترکیبات آلی را بر عهده دارد. این ژن مسئول بیوسرنتز و یاتجزیه طیف وسیعی از هورمونهای گیاهی از جمله ABA در زمان بروز تنش میباشد و همچنین از طریق کاهش اثر انواع اکسیژن فعال - ROS - 3 و ایجاد تعادل اسمزی سبب ایجاد مکانیسم دفاعی گیاه در برابر تنش شوری میشود.
