بخشی از مقاله
چکیده
پنیر لیقوان یکی از مشهورترین پنیرهاي سنتی کشور ماست که به خاطر عطر و طعم مطلوب خود از بازار پسندي و مقبولیت زیادي برخوردار است. در این تحقیق شناسایی لاکتوباسیلهاي ایزوله شده از پنیر لیقوان با استفاده از روشهاي مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی انجام گردید. آزمایشهاي بیوشیمیایی انجام شده شامل رنگآمیزي گرم، تست کاتالاز، اکسیداز، اوره آز، ذوب ژلاتین، هیدرولیز نشاسته، ارزیابی امکان رشد باکتریها در دماهاي مختلف و تخمیر قندها بود. جهت انجام آزمایشات مولکولی، پس از استخراج DNA ژنومی و تکثیر ژنوم ناحیه 16S rRNA توسط واکنش زنجیرهاي پلیمراز، تعیین توالی مولکولی ایزوله ها انجام گردید. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی ایزوله هاي جداسازي شده و تفکیک آنها، با استفاده از تکنیک RAPD انجام شد. نتایج حاصل از آنالیز مولکولی باکتریها با گونههاي مرتبط موجود در بانک ژن و همپوشانی این نتایج با داده هاي حاصل از تستهاي بیوشیمیایی انجام شده و آنالیز RAPD ، مشخص ساخت که Lactobacillus rhamnosus, L. L. paracasei, fermentum عمده ترین لاکتوباسیلهاي موجود در پنیر لیقوان می باشند.
کلمات کلیدي: پنیر لیقوان، لاکتوباسیل، DNA ژنومی، 16S rRNA، تکنیک RAPD
مقدمه
پنیر لیقوان یک پنیر نرم - با حدود % 60 رطوبت - است که با استفاده از شیر خام گوسفند و بز در منطقه لیقوان تبریز، قریه اي واقع در استان آذربایجانشرقی تولید میگردد و به خاطر عطر و طعم مطلوب خود از بازار پسندي زیادي برخوردار است. تولید پنیرهاي صنعتی با ویژگیهاي یکسان و هموژن، استفاده از انواع متنوع آغازگرها را تا حد قابل توجهی کاهش داده است و از آنجایی که شرکتهاي تولیدکننده آغازگرها در جهان تنها محدود به چند تولید کننده میباشد، لذا قابلیت دسترسی به انواع متنوعی از سویههاي آغازگر نیز محدودگشته است. پنیرهاي سنتی تولید شده از شیر خام، عطر و طعم متنوع تر و گستردهتري را نشان میدهند و این ویژگی حاصل از تنوع جنسها و گونههاي محلی و فلور میکروبی بومی ویژه شیر است . - 6 - مطالعه فلور طبیعی لاکتیکی پنیرهاي سنتی امکان تهیه استارتر جهت تولید محصولاتی سالم، با حفظ ویژگی هاي غالب را فراهم می نماید . - 5 - رشد، تکثیر و اتولیز باکتریهاي لاکتیک نقش خیلی مهمی را در ایجاد عطر و طعم پنیر دارند، چرا که در هنگام رشد و تکثیر باکتري، مقداري از مواد مغذي موجود در محیط مصرف میگردد و در نتیجه متابولیتهاي حاصله به نوبه خود بر بافت و عطر و طعم محصول تأثیر میگذارند . - 1 - در این میان، باکتریهاي لاکتیک از جمله لاکتوباسیلها، نقش مهمی در هیدرولیز پپتیدهاي کوچک و اسید آمینه هاي منشعب دارند.
اسیدهاي آمینه از جمله مهمترین عوامل دخیل در ایجاد عطر و طعم پنیر هستند که به ترکیبات مختلفی از جمله آلدئیدها، الکلها، کتونها، آمینها، استرها، اسید ها و ترکیبات سولفوردار که همگی در تولید عطر و طعم مؤثر میباشند، تبدیل میشوند 9 - ،. - 4 بدین جهت پروتئولیز، مهمترین عامل تأثیرگذار در رسیدن انواع پنیرهاست که روي بافت، عطر و طعم حاصل مؤثر است. در حال حاضر تقاضا براي محصولات با عطر و طعم متنوعتر رو به گسترش است و تولید چنین محصولاتی نیاز به دسترسی و استفاده از سویههاي جدیدتري از باکتریهاي لاکتیک دارد . - 2 - لذا شناسایی گونههاي مختلف لاکتوباسیل ایزوله شده از پنیر لیقوان، گامی اساسی براي بررسی و مطالعه اثرات تکنولوژیک این گونه ها بر خواص ارگانولپتیک پنیرهاي تهیه شده از آنها و مقایسه آنها با خواص ارگانولپتیک پنیرهاي بومی میباشد.
مواد و روشها کشت باکتریها
باکتریهاي ایزوله شده از پنیر لیقوان، در محیط کشت MRS broth کشت داده شدند. کشت باکتریها در دماي 35 ˚C و به مدت 48 ساعت درشرایط بیهوازي انجام گردید.
آزمایشات فنوتیپی
تستهاي بیوشیمیایی انجام شده شامل رنگآمیزي گرم، تست کاتالاز، اکسیداز، اوره آز، ذوب ژلاتین، هیدرولیز نشاسته، ارزیابی امکان رشد باکتریها در دماهاي مختلف و تخمیر قندها بود. براي تست قندها، محیط کشت پایه مورد استفاده، MRS broth فاقد گلوکز بود که به آن 1 ٪ از قندهاي مورد نظر و 0/01 ٪ معرف فنل رد، به عنوان شاخص تغییر pH افزوده شد. پس از تلقیح باکتریها، میکروپلیتها در دماي بهینه رشد باکتریها، انکوبه شدند . - 8 - استخراج DNA ژنومی DNA ژنومی ایزولههاي جداسازي شده، مطابق روش کوربین و همکاران ، استخراج شد . - 3 -
تکثیر ژنها
ژنوم ناحیه 16S rRNA لاکتوباسیلهاي مورد مطالعه با استفاده از پرایمرهاي عمومی تکثیر شد . - 7 - تکثیر در حجم نهایی μl 50 شامل 5/0 μl از هر پرایمر، 5 μl بافر PCR، 1 μl کلرید منیزیم 50 میلی مولار، DNA10ng الگو، 1 μl مخلوط dNTP و 0/8 μl آنزیم Taq پلیمراز، با استفاده از برنامه زیر انجام شد: یک مرحله Denaturation اولیه در95 ˚C به مدت 5 دقیقه، سپس 35 سیکل 95 ˚C به مدت 1دقیقه، 55 ˚C به مدت 50 ثانیه، 72 ˚C به مدت 90 ثانیه و درنهایت یک سیکل حرارتی نهایی 72 ˚C به مدت 10دقیقه. وجود DNA تکثیر شده 1500 bp توسط الکتروفورز در ژل آگارز تأیید شد.
تکنیک RAPD
DNA ژنومی ایزوله هاي جداسازي شده، با استفاده از 4 آغازگر RAPD و در حجمهاي 25 μl تحت واکنش زنجیرهاي پلیمراز قرار گرفت. الگوي نواربندي فرآوردههاي حاصل از واکنش PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 1/5 درصد و رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید تعیین و وجود یا عدم وجود نوار در هر نمونه یادداشت شده و دادههاي به دست آمده به وسیله نرم افزار NTSYS تجزیه شد و نمودار دندروگرام UPGMA آن رسم شد.
نتایج و بحث
با توجه به نتایج حاصل از تستهاي مورفولوژیکی و بیوشیمیایی کلیه باکتریهاي مورد مطالعه گرم مثبت، میله اي شکل، کاتالاز و اکسیداز منفی، اوره آز منفی، ذوب ژلاتین منفی، هیدرولیز نشاسته منفی بوده و رشد دمایی بهینه باکتریها، مابین 30-37˚C مشاهده گردید. منابع کربنی مورد استفاده لاکتوباسیلها عبارت بودند از: فروکتوز، گالاکتوز گلوکز، مالتوز و ریبوز که %100 باکتریها قادر به تخمیر این منابع کربنی بودند. اما آرابینوز، سلوبیوز، اسکولین، مانوز، ملیبیوز، رافینوز، رامنوز، سالیسین، سوربیتول، ساکارز و ترهالوز توسط همه باکتریها، مورد استفاده قرار نگرفتند. با توجه به توانایی تکنیک RAPD در بررسی تنوع ژنتیکی ایزوله ها و با توجه به نتایج حاصل از تستهاي مورفولوژیکی و بیوشیمیایی که الگوي یکسانی براي برخی از ایزولهها به دست آمده بود، استفاده از این تکنیک ابزار مناسبی در تفکیک ایزولههاي متفاوت به منظور ارسال توالی هاي S 16rRNA مربوطه براي توالییابی به شمار میرود. الگوي باندي حاصل از ایزولههاي لاکتوباسیل با استفاده از تکنیک –PCR RAPD در شکل 1 نشان داده شده است.
نتایج حاصل از انجام تکنیک RAPD براي لاکتوباسیلهاي جداسازي شده از پنیرهاي محلی نشان میدهد که ایزوله هاي مورد مطالعه به 3 گروه که داراي خزانه ژنتیکی متفاوتی می باشند تقسیم می شوند که این نتیجه مطابق یافتههاي حاصل از تست هاي مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بود. با استفاده از DNA ژنومی استخراج شده از نمونهها و پرایمرهاي عمومی، واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي تکثیر ژن ناحیه 16S rRNA باکتریایی انجام گرفت. محصولات واکنش PCR بعد از رنگ آمیزي با محلول اتیدیوم بروماید به صورت باندهایی با طول تقریبی 1500 bp مشاهده گردیدند. نتایج حاصل از آنالیز مولکولی باکتریها با گونههاي مرتبط موجود در بانک ژن و همپوشانی این نتایج با دادههاي حاصل از تستهاي بیوشیمیایی انجام شده و آنالیز RAPD نشان داد که لاکتوباسیلهاي غالب در پنیر سنتی لیقوان به قرار زیر می باشند:
تشکر و قدردانی
بدین وسیله مراتب تشکر و قدردانی خود را از آقاي محمد اکبري دیباور، آقاي پرویز محامد و کلیه همکارانی که ما را در انجام این تحقیق یاري نموده اند اعلام می نمایم.
