بخشی از مقاله
چکیده: انتروکوکوسها به عنوان بخش مهمی از میکروفلور طبیعی بسیاری از فرآوردههای لبنی از جمله پنیر میباشند که با فعالیتهای پروتئولیتیکی و لیپولیتیکی خود نقش بسزایی را در رسیدن پنیر و تکوین خصوصیات ارگانولپتیکی آن ایفا میکنند. این پژوهش با هدف جداسازی و شناسایی گونه-های انتروکوکسی غالب موجود در پنیر سنتی خیکی مناطق ییلاقی سوادکوه از توابع استان مازندران انجام گرفت و گونههای انتروکوکوس فیسیوم - ٍ/ٍُ % - ، انتروکوکوس فکالیس - َ/ًٍ % - ، انتروکوکوس دورانس - 20/8 % - ، انتروکوکوس رافینوسوس - 16/7 % - ، به عنوان گونههای غالب شناسایی شدند.
مقدمه:
پنیر یکی از پر مصرفترین فرآوردههای شیر میباشد که درنتیجه انعقاد کازئین به وسیله آنزیم رنین یا آنزیمهای مشابه در حضور اسید لاکتیک تولید شده توسط میکروارگانیسمها به وجود میآید - رحمتی و همکاران، . - 1374 ازجمله نکات قابل توجه در مورد پنیر، به وجود آمدن خواص ارگانولپتیکی ویژهای از نظر بافت و آروما در محصول به هنگام دوره رسیدگی است که با خواص ذاتی شیرکاملاً متفاوت است - پسونی و همکاران2003، هرروز و همکاران، لینچ و همکاران1999، مرتضوی و همکاران، . - 1388
برخی از عوامل مؤثر بر خواص ارگانولپتیکی پنیر، میزان چربی شیر، نوع باکتری، رژیم غذایی دام و روش تولید و شرایط رسیدن پنیر، میباشد - قادری و همکاران، 1389، احمدی و همکاران، . - 1387 حضور و فعالیت باکتریها در ایجاد و گسترش خصوصیات ارگانولپتیکی همیشگی است که از مهمترین آنها میتوان به باکتریهای لاکتیکی اشاره کرد که از اهمیت خاصی برخوردار بوده و در ایجاد عطر و طعم نقش بسزایی دارند - Durlu- Ozakaya, . - 2001 محصولات شیری سنتی مانند پنیر که با عدم فرآیند حرارتی و عدم استفاده از آغازگرهای میکروبی تهیه و تولید میشوند، محیط مناسبی را برای رشد و فعالیت باکتریهای لاکتیکی بومی فراهم میکنند که بطور معمول در فلور میکروبی شیر خام منطقه وجود دارند، بنابراین از این طریق وارد روند تولید پنیر شده و در ایجاد عطر و طعم تأثیر بسزایی دارند - . - Herreros et al., 2003
انتروکوکوس یکی از مهمترین جنس باکترهای اسید لاکتیک مورد استفاده در فراورههای لبنی میباشد. این گروه از باکتریها گرم مثبت، کاتالاز منفی، کوکسی شکل، هموفرمانتاتیو - - Svec and Davrie e, 2009، هوازی و بی هوازی اختیاری هستند - . - Huyck,1998 دوام انتروکوکوس در طی رسیدن پنیر میتواند به محدوده وسیع رشد دمایی 10 و 45 درجه سلسیوس، pH برابر - 4 -9/6 - و تحمل غلظت نمک برابر 6/5 درصدNaCl نسبت داده شود و همچنین، قادر به تحمل دمای 60درجه سلسیوس به مدت نیم ساعت میباشد - . - Ogier et al., 2007
انتروکوکوسها به عنوان بخش مهمی از میکروفلور طبیعی بسیاری از فرآوردههای لبنی از جمله پنیر میباشند که مهمترین گروه از این باکتریها عبارتند از: انتروکوکوس فکالیس1، انتروکوکوس فیسیوم2 و انتروکوکوس دورانس3 که بیشترین فراوانی را در بین سایر گونهها به خود اختصاص داده و به طور فراوان در محصولات لبنی یافت میشوند - موراندی و همکاران، . - 2006 بنابراین آنها میتوانند از طریق فعالیتهای پروتئولیتیکی و لیپولیتیکی - مورنو، - 2006 و همچنین با تولید ترکیبات فراری از جمله استالدئید، اتانول و استوئین نقش بسیار مهم در بافت و آرومای پنیر ایفا کنند - سونی و همکاران، . - 2003 با توجه به حضور انتروکوکوسها در مقادیر بالا در پنیرهای مختلف و اثر آنها در کمک به بهبود ویژگیهای ارگانولپتیکی فرآوردههای تخمیری و توانایی آنها در تولید باکتریوسینها، خصوصیات مهمی هستند که باعث کاربرد آنها در تهیه مواد غذایی توسط فرآوری کنندهها میگردد.
با توجه به مطالب فوق و با عنایت به اینکه در کشور ما پتانسیل خوبی برای تولید و فرآوری محصولات شیر وجود دارد و همچنین نیاز شدید جامعه صنایع غذایی جهت دستیابی و استفاده از نگهدارندههای غیر مضر، زمینههای لازم برای بررسی و تحقیق بر روی سویههای بومی موجود در محصولات سنتی کاملاً احساس میگردد. پنیر خیکی که در منطقه سوادکوه از توابع استان مازندران تولید میشود، از عمده پنیرهای سنتی است که عطر و طعم مطلوبی را برای مصرف کننده ارائه میکند.
علیرغم اینکه این پنیر از شیر خام گوسفند تهیه شده و هیچ گونه کشت آغازگری به آن افزوده نمیشود، هم از عطر و طعم بسیار قوی و مطلوبی برخوردار است و هم ماندگاری بالایی دارد. با توجه به روش تولید و ویژگیهای عطری و طعمی این نوع پنیر، احتمال میرود که دارای سوش-های متنوعی از باکتریهای لاکتیکی باشد. در صورت اثبات این مدعا، قابلیت سویههای لاکتیکی جهت استفاده به عنوان مایه میکروبی آغازگر در تهیه-ی پنیرهای صنعتی و نیز استخراج ترکیبات بازدارنده رشد میکروارگانیسم های پاتوژن، به روشهای بیوتکنولوژیک قابل بررسی خواهد بود. با توجه به نقش بسیار مهم انتروکوکوسها در تولید ترکیبات عطری و طعمی پنیرهای بومی در این مقاله حضور آنها در پنیرهای خیکی منطقه سوادکوه بررسی میشود.
مواد و روشها تهیه و جمعآوری نمونههای پنیر سنتی خیکی: نمونههای مورد نیاز از پنیرهای سنتی خیکی مناطق قلک، آلاشت و لفور در شهرستان سوادکوه از توابع استان مازندران به میزان یک کیلوگرم از هر منطقه تهیه شد. نحوه نمونه برداری از پنیرهای رسیده به صورت تصادفی و طبق استاندارد 1AOAC955.30 انجام شد. جهت رعایت شرایط بهداشتی و پیشگیری از تغییرات ناخواسته در تعادل فلور میکروبی، نمونهها را درون کیسههای استریل از جنس پلی پروپیلن - PP - 2 قرار داده و درب کیسهها را به وسیلهی دستگاه دوخت، محکم دوخت گرفته تا از نفوذ هوا به داخل آنها جلوگیری شود؛ سپس در دمای 1-4 درجه سلسیوس با استفاده از cool box حاوی کیسه یخ3 و در مدت زمان کمتر از 14 ساعت به آزمایشگاه میکروبیولوژی مواد غذایی مرکز تحقیقات فنی و مهندسی کشاورزی کرج انتقال داده شد.
روش جداسازی باکتریهای انتروکوکوس با استفاده از محیط کشت کاملا اختصاصی:
تهیه رقت: برای تهیه رقت از نمونههای پنیر، 5 گرم از هر نمونه به طور جداگانه توزین و با 45 میلیلیتر سرم فیزیولوژیک استریل مخلوط شد ، سپس به مدت 1 دقیقه با دستگاه استومکر، همگن شدند و سپس محلول رویی به عنوان اولین رقت 10-1 برای تهیه رقتهای بعدی مورد استفاده قرار گرفت. رقتهای 10-2 تا 10-6 در لولههای 90 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل تهیه شد . - Litopoulo et al., 1992 - به منظور جداسازی باکتریهای انتروکوکوس از محیط کشت اختصاصی کانامایسین اسکولین آزید آگار استفاده شد. 0/1 میلیلیتر از رقتهای تهیه شده بوسیله سمپلر بر سطح هر پلیت تزریق و به صورت پورپلیت4 کشت داده شد و سپس به مدت 24ساعت در دمای 37درجه سلیسیوس تحت شرایط هوازی گرمخانه گذاری شدند.
پس از سپری شدن مدت گرمخانه گذاری، از کلنیهای رشد یافته در هر پلیت شمارش به عمل آمد و از لحاظ ویژگیهای ظاهری - شکل، اندازه، کدر یا شفاف بودن، محل قرار گرفتن در سطح یا عمق و ... - مورد بررسی قرار گرفتند. کلنیهایی که دارای اشکال متفاوت بودند به صورت جداگانه روی محیط کشتیاد شده، کشت سطحی داده شدند و مجددا در شرایط مذکور گرمخانه گذاری شدند تا عمل خالص سازی و جداسازی صورت گرفت . - Lopez-Diaz et al., 2000 -
روش شناسایی فنوتیپی باکتریهای انتروکوکوس: برای شناسایی باکتریهای لاکتیکی، روشهای فنوتیپی شامل بررسیهای مورفولوژیکی و آزمونهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی کاربرد وسیعی دارند. بر همین اساس و با توجه به فراهم بودن امکانات، از این روشها استفاده شد.
بررسیهای مورفولوژیکی: پس از به دست آوردن کلنیهای تک، از آنها اسلاید تهیه شد و از نظر آزمون رنگ آمیزی گرم، فعالیت کاتالازی و مورفولوژی سلولی مورد بررسی قرار گرفتند - . - Greco et al., 2005 سویههای باکتریایی گرم مثبت و کاتالاز منفی جداسازی شدند و برای آزمونهای بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. آزمونهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی: برای شناسایی جدایهها در حد گونه از آزمونهای زیر استفاده شد؛
- آزمون رشد در دماهای 10°C و :45 °C به این منظور رشد جدایهها در دماهای 10°C و 45 °Cبه مدت 7 روز گرمخانه گذاری و تلقیح در MRS مایع بررسی شد - . - Bulut, 2003
- آزمون رشد در غلظت نمک :NaCl%6/5 برای انجام این آزمایش محیط کشت MRS مایع حاوی %6/5 نمک تهیه و از کشت ایزوله به درون آنها تلقیح شد، سپس به مدت 7 روز، در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری گردیدند. رشد میکروارگانیسمها در هر یک از این دماها با مشاهده کدورت - مقایسه با لوله شاهد - ، رسوب و تشکیل حلقه نازکی از رسوب بر سطح محیط کشت تعیین شد - . - Bulut, 2003
- آزمون رشد در : pH=9/6 به این منظور رشد جدایهها در محیط کشت MRS مایع با pH=9/6 بررسی گردید.
- آزمون تخمیر کربوهیدراتها: به منظور شناسایی کاملتر جدایهها در سطح گونه تخمیر کربوهیدراتها شامل - گلوکز، لاکتوز، مانیتول، مانوز، گالاکتوز، سالیسین، آرابیوز، مالتوز، ملی بیوز، رافینوز، ساکارز، اسکولین، ریبوز، سربیتول، ترهالوز - در محیط پایه با فرمول زیر پیگیری شد - پروتئوز پپتون 10گرم، عصاره مخمر 5گرم، دی پتاسیم فسفات 2گرم، سدیم استات 5 گرم، منیزیم سولفات /02گرم، منگنز سولفات 0/05گرم، آب مقطر 1000میلی لیتر، 1 میلی لیترتوئین 80 و %0/05 کلروفنل به عنوان شاخص تغییر pH و%1 غلظت قند نهایی - انجام شد - . - Ranganna, 1993 نتایج آزمایشهای بیوشیمیایی جدایههای شناسایی شده با خصوصیات بیوشیمیایی باکتریهای اسید لاکتیک در کتاب برگی و کتاب جنسهای باکتریهای اسید لاکتیک مطابقت داده شد - - Sneath et al., 1986 و جدایهها در سطح جنس و گونه شناسایی شدند.
نتایج و بحث:
واکنش تخمیر قندها:
همانگونه که در بالا اشاره گردیده است به طور کلی برای شناسایی کاملتر گونههای انتروکوکسی، تخمیر قند پیشنهاد میگردد.
