بخشی از مقاله
چکیده
روتا ویروس هاي گروه A عامل عمده ایجاد اسهال در گوساله هاي زیر یک ماه بوده و همه ساله خسارات اقتصادي هنگفتی ببار می آورد. جهت تشخیص سریع بیماري می توان از روش هاي سرولوژي و مولکولی استفاده کرد ولی براي جداسازي ویروس به روش هاي خاص کشت سلولی و نیز تیره سلولی مناسب احتیاج است. در این تحقیق تعداد 41 نمونه مدفوع که از گوساله هاي اسهالی تا سن یک ماه، از گاوداریهاي صنعتی و نیمه صنعتی استان هاي تهران و البرز تهیه شده و در تشخیص آلودگی روتا ویروسی با انجام روش RT-PCR با پرایمرهاي ژن VP6، مثبت بودند، پس از آماده سازي و تلقیح بر کشت سلولی MA104، در لوله هاي کشت سلول در دستگاه Roller Tube Culture و نیز در فلاسک هاي کشت سلول ثابت، براي یک پاساژ اولیه و 4 پاساژ کور متوالی مورد بررسی قرار گرفتند.
در 13 نمونه از آنها ضایعات سلولی - CPE - مشاهده گردید. کشت هاي واجد ضایعات سلولی، با انجام روش RT-PCR دو مرحله اي با استفاده از پرایمرهاي ژن VP6 مورد تأیید قرار گرفتند. جهت ژنوتایپینگ G، از پرایمرهاي ژن VP7، روشSemi -nested PCR انجام گرفت که 11 نمونه از نظر ژنوتایپ، G6 و 2 نمونه G10 بودند. این اولین گزارش جداسازي و تعیین هویت روتا ویروس هاي عامل بیماري اسهال ویروسی گوساله ها در ایران می باشد. نتایج این بررسی اشاره می کند که باید در تهیه واکسن مناسب براي پیشگیري از اسهال روتا ویروسی این مناطق از این دو تایپ روتا ویروسی، بعنوان سوش هاي غالب استفاده نمود. با استفاده از پروتکل بکار رفته در این تحقیق می توان نسبت به جداسازي و تایپینگ روتاویروس هاي عامل اسهال ویروسی گوساله ها در تمام مناطق کشور جهت تهیه تمام سوش هاي بومی اقدام و گام مهمی در کنترل، مبارزه و نیز ریشه کنی از طریق تهیه واکسن مناسب برداشت.
کلمات کلیدي: روتا ویروس، جدا سازي، ایران
مقدمه و هدف
روتا ویروس هاي گروه A عامل عمده ایجاد اسهال در اکثر گونه هاي دامی بوده و مرگ و میر گوساله هاي زیر یک ماه خسارات اقتصادي هنگفتی را به سیستم هاي دامپروري وارد می نماید 7 - ، . - 10 به لحاظ خصوصیات بیولوژیکی و ساختمانی خاص این ویروس، براي جداسازي و شناسایی ویروس عامل بیماري به روش هاي خاص آماده سازي نمونه و کشت سلولی - با اضافه کردن تریپسین - و تیره سلولی مناسبی احتیاج است. در میان روشهاي تشخیصی ، RT-PCR روش کارآمدتري گزارش شده است چون قادر به تایپینگ دامنه وسیعتري از نمونه هاي روتا ویروس مثبت میباشد. 1 - ، 5، . - 10 در مورد تشخیص عفونت هاي روتا ویروسی گزارشات متعددي در کشور وجود دارد ولی در خصوص جداسازي ویروس و تعیین سروتیپ هاي غالب آن تاکنون گزارشی در کشور وجود نداشته و این تحقیق اولین گزارش در این خصوص می باشد.
مواد و روشها
در این تحقیق مجموعاً تعداد 41 نمونه مدفوع اسهالی گوساله هاي تا سن یک ماه از گاوداریهاي صنعتی و نیمه صنعتی شهرستان هاي شهریار، اسلامشهر، رباط کریم، ساوجبلاغ، ورامین، ري، پاکدشت و دماوند در استان هاي تهران و البرز که در تشخیص آلودگی روتا ویروسی با انجام روش RT-PCR با پرایمرهاي ژن VP6 مثبت اعلام شده بودند جهت جداسازي و تایپینگ ویروس دریافت گردید. ابتدا سوسپانسیون %10 مدفوع تهیه و پس از سانتریفوژ و برداشت محلول رویی و عبور از فیلتر، تریپسینه شده و پس از شستشوي سلول هاي رشد یافته MA104 - سلول کلیه جنین میمون رزوس - در لوله هاي کشت سلول در دستگاهRoller Tube Culture و فلاسک هاي کشت سلول ثابت که به منظور حذف سرم صورت می گرفت تلقیح و پس از مدت زمان جذب، محیط کشت DMEM حاوي تریپسین و محیطTryptose Phosphate Broth به آنها اضافه گردیده و در انکوباتور قرار داده می شدند.
تمامی سلول ها بمدت 14 روز جهت مشاهده ظهور ضایعات سلولی - CPE - هر روز در زیر میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار می گرفتند. در صورت عدم مشاهده CPE پس از سه مرتبه عمل ذوب و انجماد از آنها پاساژ کور بعمل می آمد و تا 5 پاساژ ادامه می یافت. در صورت مشاهده CPE کار آماده سازي جهت تأیید تشخیص با روش RT-PCR انجام می گرفت. ابتدا با روش RT-PCR دو مرحلهاي با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژن VP6 از نظر روتا ویروس گروه A، مورد بررسی قرار می گرفت. جهت تشخیص ژنوتایپ نمونه هاي روتاویروس مثبت، انجام PCR اولیه براي ژن VP7 با پرایمرهاي اختصاصی ژن VP7 صورت می گرفتنهایتاً. جهت تشخیص ژنوتایپ G نمونه هاي روتاویروس مثبت از محصول PCR اولیه براي ژن VP7، واکنش Semi nested PCR با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژنوتایپهاي G5، G6، G8، G10 و G11 صورت گرفت و G تایپینگ مشخص گردید.
نتایج
در 13 نمونه ضایعات سلولی - CPE - مشاهده گردید. ظهور CPEمعمولاً در روز سوم و یا چهارم پس از تلقیح شروع می شد و بعد از 2-3روز به حداکثر تخریب سلولی که حدوداً %80-90 بود می رسید. - شکل . - 1-تمامی 13 نمونه از کشت هاي سلولی که واجد CPE بودند در PCR ژن VP6 مثبت بودند. در ژنوتایپینگ G نمونههاي روتا ویروس مثبت از 13 نمونه که PCR ژن VP6 آنها مثبت بود، ابتدا واکنش RT انجام شد و سپس، PCR براي ژن VP7 انجام گرفت و محصول آن بر روي ژل مشاهده گردید. در تمامی 13 نمونه، نتیجه PCR ژن VP7 مثبت بود. در Semi nested PCR براي G ژنوتایپینگ ژنوتایپ هایی که در این مطالعه مشخص شدند، G6 و G10 بودند. از 13 نمونه جداسازي شده از کشت سلول که از نظر ژن VP6 و VP7 مثبت بودند با انجام Semi nested PCR و با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژنوتایپهايG5، G6، G8، G10 و G11، تعداد 11 نمونه G6 و 2 نمونه از نظر ژنوتایپ، G10 بودند - شکل . - 2-
بحث
روتاویروسهاي گروه A معمول ترین عوامل اولیه ایجاد کننده گاستروآنتریت حاد در نوزادان بسیاري از پستانداران میباشند و خسارت هاي اقتصادي سنگینی را ایجاد میکنند - 4، 6، . - 7 روتا ویروس ها تنوع آنتی ژنیکی بسیاري دارند و این مسئله پیچیدگیهایی را در امر تشخیص، اپیدمیولوژي و واکسیناسیون علیه آنها ایجاد کرده است - 2، . - 8 لذا بررسی و مطالعه در مورد ژنوتایپها و سروتایپهاي روتا ویروسهاي گروه A جهت دستیابی به اطلاعات اپیدمیولوژیک اهمیت دارد 2 - ، . - 5 روتا ویروسهاي گروه A بنا به خصوصیات آنتی ژنیکی و یا ردیف ژنومی پروتئینهاي VP4 و VP7 به ترتیب به تایپ هاي P و G تقسیم بندي میشوند. این تایپ بندي می تواند با روشهاي سرولوژیکی یا مولکولی بررسی شود.
تاکنون 15 ژنوتایپ G و 26 ژنوتایپ P شناخته شده است که از میان آنها 8 ژنوتایپ G و 6 ژنوتایپ P شناسایی شده اند - 3، . - 5 روش تعیین تایپ روتا ویروسها به وسیله PCR حساس و بسیار سریع میباشد . - 3 - اولین جداسازي روتا ویروس از کشت سلولی در سال 1972 توسط Mebus و همکاران صورت گرفت . - 7 - روش تریپسینه کردن نمونه قبل از تلقیح و نیز اضافه کردن تریپسین به محیط کشت نگه دارنده توسط Sato و همکاران در سال 1981 ارائه گردید . - 9 - در خصوص جداسازي روتا ویروس با استفاده از سلولهاي MA104 و تریپسینه نموده نمونه ها و تأیید تشخیص با روش seminested RT-PCR با پرایمرهاي اختصاصی ژنوتایپ گزارشاتی در کشورهاي خارج وجود دارد 2 - ، 5، 6، . - 8
نتیجه گیري نهایی
روش هاي مورد استفاده در این تحقیق و نتایج بدست آمده با نتایج محققین سایر کشور ها مطابقت دارد. نتایج حاضر نشان میدهند که تایپهاي عمده روتا ویروس گاوي در گاوداري هاي شیري صنعتی و نیمه صنعتی تهران و استان البرز با آزمایش semi nested PCR تایپهاي G6، و G10 میباشند. لذا یک واکسن مناسب براي پیشگیري از اسهال روتا ویروسی در گوساله ها در این مناطق باید این دو تایپ روتا ویروسی G6، و G10 را پوشش دهد. با اینحال باید تعیین تایپ هاي روتا ویروس گاوي در گردش در این مناطق و سایر مناطق ایران بطور مداوم انجام گیرد تا درك بهتري از اپیدمیولوژي شیوع روتا ویروس گاوي در مناطق مختلف حاصل شود و در نتیجه آن، واکسن مؤثري علیه روتا ویروس گاوي ساخته شود.
