بخشی از مقاله
چکیده
طاعون نشخوارکنندگان کوچک - PPR - بیماري ویروسی بسیار مسري بوده که عامل آن یک موربیلی ویروس از خانواده پارامیکسوویریده می باشد و سبب خسارتهاي اقتصادي زیادي می گردد. به دلیل گزارشات متعدد مبنی بر وجود بیماري در مناطق مختلف ایران پرداختن به جنبه هايگوناگون بیماري خصوصاً در مقوله جداسازي ویروس به جهت تعیین ماهیت ژنتیکی آن و نیز استفاده ازایزوله هاي بومی جهت تهیه واکسن مؤثر اهمیت زیادي دارد. در این تحقیق تعداد 168 نمونه شامل خون کامل، سواب چشمی، بینی و دهانی و عقده هاي لنفاوي از گوسفندان و بزهاي داراي علائم بالینی استانهاي قم، فارس، اردبیل، قزوین، آذربایجان شرقی و غربی، لرستان، تهران و کرمان تهیه گردید و تحت شرایط استاندارد به آزمایشگاه ویروس شناسی حمل و پس از آماده سازي، بر روي تیره سلولی Vero و نیز سلول پرایمري LK تلقیح و براي حداقل 5 پاساژ متوالی از نظر بروز ضایعات سلولی مورد مشاهده قرار گرفتند.
کشت هاي داراي ضایعات، از نظر مشاهده با میکروسکوپ الکترونی و نیز تأیید تشخیص به روش RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه هاي مربوط به گوسفندان استان هاي آذربایجان شرقی و کرمان در هر دو سلول هاي Vero و LK ضایعات سلولی ایجاد کردند. در بررسی میکروسکوپ الکترونی اجرام ویروسی که از نظر شکل ظاهري و اندازه، شبیه پارامیکسوویروس ها بودند مشاهده گردید. نتایج روش RT-PCR نیز در مورد آنها مثبت بود. با این نتایج بیماري PPR در بعضی از کانون هاي مورد بررسی تأیید می گردد.
واژه هاي کلیدي: طاعون نشخوارکنندگان کوچک، جداسازي، شناسایی
مقدمه و هدف
طاعون نشخوارکنندگان کوچک - PPR - بیماري ویروسی بسیار مسري نشخوارکنندگان کوچک اهلی و وحشی بوده و سبب خسارتهاي اقتصادي زیادي در نشخوارکنندگان کوچک می گردد . - 7 - گزارش بیماري اولین بار از منطقه ساحل عاج در غرب آفریقا بوده است - . - 5 با گذشت زمان و گسترش جغرافیایی و افزایش خسارتهاي ناشی از آن، اهمیت بیشتري یافته است. بیماري بدلیل تداخل در ریشه کنی جهانی طاعون گاوي نقش ویژه اي پیدا کرده است - . - 6 این بیماري از غرب تا شرق آفریقا و کشورهاي عربی، خاورمیانه و جنوب آسیا و همچنین ایران را در بر گرفته است 1 - ، 2، 4، . - 8 به دلیل گزارشات متعدد مبنی بر وجودبیماري در مناطق مختلف ایران پرداختن به جنبه هاي گوناگون بیماري خصوصاً در مقوله جداسازي ویروس به جهت تعیین ماهیت ژنتیکی آن و نیز استفاده ازایزوله هاي بومی جهت تهیه واکسن مؤثر اهمیت زیادي دارد. ژنوم ویروس به شش قسمت قابل رو نویسی تقسیم می شود که دو پروتئین غیر ساختمانی - V,C - و شش پروتئین ساختمانی را کد می کنند. بدلیل متفاوت بودن اندازه ناحیه اتصالی بین F,M، طول ژنوم موربیلی ویروس ها متغیر است. تشخیص PPR می تواند با جداسازي ویروس، تعیین آنتی ژنهاي ویروسی، تعیین توالی اسیدهاي نوکلئیک و با تعیین آنتی بادي اختصاصی در سرم باشد . - 3 -
مواد و روش ها
تعداد 168 نمونه شامل خون کامل، سواب چشمی، سواب بینی، سواب دهانی و عقده هاي لنفاوي - برونکیال، مدیاستینال و مزانتریک - از گوسفندان و بزهاي داراي علائم بالینی PPR از گوسفند داریهاي استانهاي قم، فارس، اردبیل، قزوین، آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، لرستان، تهران و کرمان تهیه و تحت شرایط استاندارد به آزمایشگاه ویروس شناسی حمل و پس از آماده سازي تا زمان آزمایش در درجه حرارت -70 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. در بعضی از موارد از دامهاي داراي علائم بالینی ابتدا با استفاده از کیت هاي صحرایی تشخیص سریع موربیلی ویروسها از نمونه هاي سوابهاي ترشحات بینی و چشمی آزمایش به عمل می آمد درو صورت مثبت بودن اقدام به نمونه برداري کامل تر و بعضاً ذبح دام جهت نمونه برداري از اندام هاي داخلی می گردید. نمونه ها پس از آماده سازي بر روي تیره سلولی Vero و نیز سلول پرایمري - Lamb Kidney - LK تلقیح و پس از جذب ویروس به سلول، محیط کشت DMEM حاوي FBS به سلول ها اضافه و در درجه انکوباسیون مناسب قرار داده می شدند.
هر نمونه براي مدت 14 روز از نظر ضایعات سلولی - - CPE بررسی و در صورت عدم مشاهده ضایعه سلولی پس از دو مرحله انجماد و ذوب از آنها پاساژ کور تهیه و این کار حداقل براي 5 مرتبه ادامه می یافت. از موارد مثبت سلولهاي ضایعه دیده در هر پاساژ ممکنه، پس از 2مرتبه عمل ذوب و انجماد و دو مرحله سانتریفوژ، نمونه هایی آماده گردیدهپس از تهیه گرید و رنگ آمیزي منفی با فسفو تنگستیک اسید، جهت مشاهده اجرام ویروسی در زیرمیکروسکوپ الکترونی جستجوي ویروس، مورد بررسی قرار می گرفت. از موارد مثبت سلولهاي ضایعه دیده، بوسیله محلول استخراج RNA ویروسی بر طبق دستورالعمل آن، RNA ویروسی استخراج و واکنشRT با استفاده از کیت معتبر صورت گرفت. RNA و Random hexamer primer بر طبق برنامه حرارتی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد و سپس واکنش PCR با استفاده از پرایمرهاي ژن F ویروس PPR و همچنین Nested PCR صورت گرفت. پس از تهیه ژل و با استفاده از محلول TBE مشاهده باندهاي اختصاصی PPR در محدوده مورد نظر صورت گرفت.
نتایج
نمونه هاي سواب چشمی و بینی از دو گوسفندداري مربوط به استان هاي آذربایجان شرقی و کرمان در تشخیص سریع موربیلی ویروس ها با استفاده از کیت هاي صحرایی واکنش مثبت نشان دادند. از دام هاي فوق پس از ذبح، نمونه هایی از عقده هاي لنفاوي تهیه گردید. نمونه هاي مربوط به خون کامل و عقده هاي لنفاوي دو واحد از گوسفندداریهاي استان هايآذربایجان شرقی و کرمان که در روش تشخیص سریع مثبت بودند، پس از 4-5 روز از تلقیح به سلولهاي Vero و LK ضایعه سلولی - CPE - ایجاد گردید. در نمونه عقده لنفاوي که نتیجه کیت سریع آن مثبت بود و نیز در کشت هاي سلولی واجد ضایعه سلولی، در زیر میکروسکوپ الکترونی، اجرام ویروسی در اندازه هاي 150-300 نانومتر مشاهده گردید که از نظر شکل ظاهري و اندازه، شبیه پارا میکسوویروس ها بودند. در نمونه هایی که در کشت سلول واجد CPE بودند و در زیر میکروسکوپ الکترونی در آنها اجرام ویروسی مشاهده شده بود در RT-PCR و Nested PPR، باندهاي مثبت را نشان دادند.
بحث
بیماري PPR بدلیل تداخل در ریشه کنی جهانی طاعون گاوي و برنامه هاي سرواپیدومیولوژیکی آن نقش ویژه اي پیدا کرده است . - 8 - ویروس PPR مانند دیگر موربیلی ویروسها داراي یک غشاء است که دو گلیکو پروتئین سطحیF و H روي آن قرار داردعمدتاً. این دو پروتئین مسئول ایجاد ایمنی محافظت کننده در دام هستند و آنتی بادي ضد آنها سبب خنثی سازي ویروس می گردد. پروتئین F واسطه فیوژن بین غشاء ویروس و غشاء سلول یا بین سلول آلوده و سلولهاي مجاور است. بنابر این نقش کلیدي در نفوذ ویروس به سلول و انتشار آن داخل بدن میزبان را دارد. پروتئین F ویروس PPR حتی قادر است در غیاب پروتئین هايH/N به فعالیت بیولوژیک خود ادامه دهد. با مروري بر گزارش هاي بیماري PPR در ایران، مشخص شده
