بخشی از مقاله
چکیده:
باکﱰیهای متعلق به جنس Marinobacter ، جز باآﱰیهای شور پسندند که به زندگی در غلظتهای ﳕکی3- 15 % Na cl سازش یافته اند.اعضای این جنس میله ای، گرم منفی و هوازی اندو کاربردها ی فراوانی در بیوتکنولوژی دارند.این باکﱰی ها گروه قابل توجهی از میکروارگانیسمها هستند که به عنوان منبعی از آنزﳝها ی سازش یافته به ﳕک در نظر گرفته می شوند. کلنی این باکﱰی ، با تلقیح 400 ml از ﳕونه های آبی روی ﳏیط MH اگار جدا سازی شد.باآﱰی فوق دارای رشد اپتی موم در دمایpH :7-6 , 32 -26 C و حضور Nacl 7 /5 % بود.هییچ گونه رشدی در غیاب Nacl صورت نگرفت. موقعیت فیلوژنتیکی این باکﱰی با تکثﲑ ژن 16S rRNA و توالی یابی مستقیم آن تعیﲔ شد. نتایج بدست آمده با توالی های 16srRNA باکﱰیهای دیگر موجود در بانک اطلاعاتی مقایسه شد. آنالیزهای فیلوژنتیکی بر پایه توالی ژنی 16srRNA ، نشان داد که این باکﱰی درون جنس Marinobacterدر کلاس گاما پروتئوباکﱰی قرار می گﲑد. برای تعیﲔ موقعیت تاکسونومی باکﱰی فوق الذکر، مطالعات فنوتیپی بیشﱰی مورد نیاز می باشد.تواﱄ 16S rDNA این باآﱰي در NCBI ثبت گردید.
کلمات کلیدي: باآتریهاي شور پسند،ژن ریبوزومی16 S rRNA ، واآنش زﳒﲑه ای پلیمراز
مقدمه:
جنس Marinobacter در سال 1992 توسط Gouthier مطرح شد 7 - ، 6 ،5، . - 4اعضای این جنس ، باکﱰیهای میله ای ، گرم منفی، بدون اسپور وهوازی اندکه تنوع وسیعی از هیدروکربنها را به عنوان تنهامنبع کربن وانرژی به کارمی برند - 10 ، . - 8 این جنس در زیرکلاس گاما پروتئوباکﱰیهاقرار می گﲑد 7 - ، 6،5،. - 4شناسایی آنزﳝها ی هیدرولیتیکی خارج سلولی که دارای فعالیت اپتی مال در غلظتهای ﳐتلف ﳕک اند، به عنوان زمینه ﲢقیق جالبی،نظرﳏققان را به خود جلب ﳕود - . - 4 وجود چنﲔ آنزﳝهایی،پروسه های صنعتی ﳐتلفی که نیازمند فعالیت در غلظتهای بالاي ﳕکند را، تسهیل می کند. آنزﳝهای لیپولیتیک که اکثرآ شامل لیپازها و اسﱰازها هستند، در صنایع ﳐتلفی نظﲑ صنایع غذایی ،دارویی،شیمیایی کاربردها ی فراوانی دارند - . - 4
این گروه از پروتئوباکﱰیهای دریایی، ﲡزیه کننده های بیولوژیکی کارایی از هیدروکربنها، کربنهای اروماتیک چند حلقه ای و ترکیبات اسیلیک ایزوپرنوییدی هستند - . - 7 مطالعات متابولیتهای Marinobacter spp با ویژگی های ساختاری کارا نشان میدهد که این باکﱰیها به عنوان مارکرهای بیولوژیکی، نقش مهمی در ﲡزیه میکروبی ﳏیط آبی دارند.به منظور بررسی تنوع ژنتیکی باکﱰیها، متداولﱰین روش، تکثﲑ ژهنای 16S rRNA، 23 S rRNA و توالی یابی مستقیم آهنا می باشد - - 2003 - Martin et al. - 12 با این متد از خاك شور cadiz در اسپانیا، - Marinobacter lipolyticus با فعالیت لیپازی - - - 4 - 2004 - Yoon et al از آب در یای زرد کره - 5 - M.daepoensis M.flavimarisو - 1999 - Huu et al از زمینهای ساحلی نفت/گاز در جنوب ویتنام، M.aquaeolei را جدا سازی و شناسایی ﳕودند - . - 9
مواد و روشها:
ﳕونه های آ ب بطور جداگانه , Halomonas ﳏیط , LB 7% ﳏیط MH - ، روی 3 ﳏیط ﳐتلف - آشت داده شدند و در دمای 30º به مدت 7 روز انکوبه گردیدند. از آلنی های حاصل استوك ﲥیه شد 700 - میکرولیﱰ از باآﱰیهای رشد یافته در ﳏیط مایع و 300 میکرولیﱰگلیسرول اسﱰیل - و در ﳜچال -70 برای اﳒام مراحل بعدی نگهداری شدند.
PCRو الکﱰوفورز:
به منظور بررسی و تعیﲔ هویت باآﱰیها، ژن 16S rRNA با پراﳝرهای مربوطه و واآنش زﳒﲑه ای پلیمراز تکثﲑ گردید. ترآبب PCR mix به حجم 50μl برای هر واآنش از KCl با غلظت 50Mm، Tris-HCl با غلظت - pH:8 /4 - 10Mm ، هر داآسی ریبونوآلئوتید تری فسفاته 200μM، MgCl2 با غلظت 1/5mM، 0/5μM از هر پراﳝر، 1 واحد از آنزﱘ - Polymerase Taq-DNAسیناژن - ، ./4μl از استوك باآﱰیایی و 39/9μl آب مقطر اسﱰیل دیونیزه استفاده شد. واآنش PCR در دستگاه ترموسایکلر Eppendorf - -آﳌان - به شرح زیر اﳒام شد:پنج دقیقه در حرارت Cْ95 سپس 35 سیکل حرارتی شامل Cْ95 یک دقیقه، Cْ55 پنجاه ثانیه، Cْ72 هشتاده و پنج ثانیه ودر هنایت یک سیکل حرارتی Cْ72 به مدت ده دقیقه.بعد از اﳒام واآنش PCR ، ﳕونههای PCR شده در ژل آگاروز 1 درصد در آنار مارآر1 kb - فرمنتاز - با ولتاژ 90 ولت الکﱰوفورز گردیدند.
نتایج و ﲝث:
بعد الکﱰوفورز و مشاهده باند bp ١٥٠٠ ، ﳏصول PCR مستقیما توالی یابی شد.نتیجه حاصل با توالی های 16S rDNA باکﱰیها در NCBI بلاست و مقایسه شد. این باکﱰی بیشﱰین شباهت را با اعضای باکﱰیهای متعلق به جنس Marinobacter داشت.از آﳒایی که توالی این باکﱰی در Multaline با اعضای جنسMarinobacter، در یک نوکلئوتید تفاوت بارز داشت به عنوان باکﱰی جدید متعلق به این جنس در نظر گرفته شد. باکﱰی جدا شده گرم منفی، شور
