بخشی از مقاله
چکیده
حیوانات خانگی مثل گربه و سگ و برخی جوندگان منابع بالقوه انتقال برخی از بیماری های زئونوز به انسان به ویژه در کودکان و نوزادان میشود .باکتری یرسینیا یکی از عوامل باکتریایی که باعث عفونت و بیماری در نوزادان و کودکان میشود. هدف از اجرای این تحقیق پیدا کردن میزان شیوع آلودگی یرسینوری در سگهای ارجاعی به کلینیک دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون می باشد. در این تحقیق درفاصله زمانی ماه های اردیبهشت تا مهر 1393 حدود 46 سگ جهت واکسیناسیون به کلینیک دامپزشکی ارجاع داده میشدند و به نظر سالم بودند.نمونه ی مدفوعی گرفته و بعد از کشت و جداسازی باکتری Y.enterocolitica با روش PCR توسط پرایمر های اختصاصی یرسینیا انتروکولیتکا نسبت به جداسازی یرسینیا اقدام گردید.هفت قلاده از چهل و شش قلاده سگ مورد آزمایش یرسینیا مثبت بودند.
نتایج این تحقیق نشان میدهد %15/21 سگ های ارجاعی به کلینیک مثبت بوده اند، بدون آنکه صاحبان سگ متوجه علائم آنها بشوند .شرایط نگه داری نامناسب و هم چنین غذای آلوده از مهم ترین عوامل وجود آلودگی در سگ ها بود.Y.enterocolitica در سگ ها وگربه هایی دیده میشودکه لاشه ی جوندگان مرده و پرندگان آلوده رامصرف کرده اند. این باکتری باعث ایجاد انتروکولیت در انسان خواهد شد . پس از خورده شدن باکتری Y.enterocolitica در روده تکثیر پیدا میکند. اسهال خونی و تب از نشانه های بیماری است. باکتری Y.enterocolitica از طریق آب و غذای آلوده به انسان منتقل میشود. در این تحقیق محققین سعی کردند که با آزمایش درصد مبتلایان به یرسینیوز در سگ های خانگی و گله های شهرستان کازرون را پیدا نموده و راهکارهای مناسبی را ارائه نمایند.
کلمات کلیدی :بیماری زئونوز، یرسینیا انتروکولیتیکا، سگ
مقدمه
امروزه حیوانات خانگی نقش مهمی در زندگی انسان داشته است به طوریکه در بعضی از مناطق نگه داری از حیوانات خانگی جز مهمی از زندگی انسانی شده است .این نزدیکی بین محیط زیست حیوان و انسان باعث شده است که بیماری مشترک حیوان و انسان نیز مورد توجه جوامع بشری قرار بگیرد.در اکثر مناطق جهان مراکز نگه داری از حیوانات نقش بارز و مهمی در انتقال بیماری های مشترک انسان و دام داشته و دارد .اگرچه که تاکنون بیش از هفتاد عامل بیماری زا که به طور مشترک بین انسان و دام ایجاد بیماری میکند، گزارش شده است اما این مورد که نگرانی از بیماری های مشترک انسان و دام منجر به حذف حیوانات خانگی از زندگی بشر بشود درهیچ جای دنیا گزارش نشده است.
تماس مستقیم با حیوانات یکی از مهم ترین فاکتور های خطر برای انتقال پاتوژن و عامل بیماریزا به انسان میباشد.اما راه های دیگری نیز جهت انتقال بیماری از انسان به دام و از دام به انسان گزارش شده است سگ وگربه دو حیوان خانگی هستند که امروزه تقاضای زیادی برای تربیت و نگه داری آن ها در خانواده های بشری وجود دارد .این حیوانات یکی از منابع بالقوه انتقال بیماری به ویژه به کودکان و نوجوانان هستند . یکی از این عوامل بیماری زا یرسینیا دوگونه ی یرسینیا شامل Y.pseudotuberculosis،Y.enterocolitica میباشد.باعث بروز یرسینیوز دردام و انسان میشود مشخص ترین علامت بالینی یرسینیوز اسهال بویژه در کودکان است Y.pseudotuberculosis
عامل ایجادکننده عفونت های تک گیر و همه گیر در حیوانات بوده و گسترش زیادی در حیوانات اهلی و حیوانات مزرعه و حیوانات وحشی دارد.حیوانات خانگی نظیر گربه وسگ ممکن است منبع عفونت Y.pseudotuberculosis بوده و در ماه های سرد که تماس مستقیم با انسان بیشتر است باکتری را از طریق مدفوع ممکن است به انسان منتقل کند ،حدود ده هزار باکتری در هر گرم مدفوع سگ و گربه نشاندهنده ی ناقل بودن سگ و گربه است ، انسان هایی که دارای ریسک زیادی برای مبتلا شدن هستند - کودکان و افراد دچار نقصان سیستم ایمنی - ممکن است از طریق خوردن و آشامیدن آب و غذای آلوده و با تماس نزدیک با حیوانات مبتلا شوند.در این تحقیق محققین سعی کردند که با آزمایش درصد مبتلایان به یرسینیوز درسگ های خانگی و گله های شهرستان کازرون را پیدا نموده و راهکارهای مناسبی را ارائه نمایند.
مواد و روش کار
نمونه ی مدفوعی از چهل وشش سگ بدون نشان دادن علائم بالینی مراجعه شده به کلینیک دریک دوره هفت ماهه با یک سوآپ استریل تهیه گردید و به آزمایشگاه میکروبیولوژی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون ارجاع داده شد . در یک محیط مک کانکی آگار کشت داده شد و پس از بیست و چهار ساعت گرم خانه گذاری در سی و هفت درجه سانتی گراد کلنی ها ظاهرشدند ،که با توجه به خصوصیات شان بیانگر حضور یرسینیا میباشند یک سوسپانسیون یک میلی لیتری در آب مقطر استریل تهیه گردید وبه طورکامل ورتکس گردید درهرنمونه مایع هموژن حاصل از ورتکس را به یک میکروتیوپ استریل مستقل و بارور در6000 rmp به مدت 5 دقیقه ساتریفیوژ گردید.پس از انتقال مایع رویی به میکروتیوپ استریل دیگر حدودا در دور 10000 rmpبه مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ انجام گردید و رسوب به دست آمده جهت استخراج DNA با کیت شرکت سینا ژن مطابق دستورالعمل سازنده مورد استفاده قرار گرفت. 200میکرولیتر ازنمونه ی مشکوک را با 200
میلی لیترlusisbuffer بافر و 100 میکرولیتر پروتئین کینازKدر دمای 65 درجه سانتی گرد به مدت 30 دقیقه انکوبه و گرمخانه گذاری کردیم بعد از گرمخانه گذاری 250 میکرولیتر از بافر بایندینگ و 250 میکرولیتر اتانول هشتاد درصد به محلول اضافه میکنیم .نمونه با ماده شستشو موجود در کیت شستشو داده شد. DNA استخراج شده در بافر 50 Elutionbuffer میکرولیتر قرار گرفته شد. DNA استخراج شده جهت انجام آزمایش PCR به آزمایشگاه ژنتیک منتقل گردید. آزمایش PCR از ژن هدف گذاری شده OMPF برای شناسایی Y.enterocolitica درPCR استفاده گردید. پرایمر جلویی به صورت 5-GTCTGGGCTTTGCTGGTC-3 و برای پرایمرعقبی به صورت5-GCGTCGTATTTAGCACCAACG - 3 بود .
این پرایمرها قادر به تکثیر یک قطعه 428 جفت سازی در ژن OMPFباکتری یرسینیا انتروکولیتیکا میشود. واکنش PCR برای تکثیر ژنOMPF با استفاده از پرایمر های اختصاصی و ژنوم باکتری یرسینیا انتروکولیتکا انجام شد. برای انجام این واکنش ابتدا یک مخلوط واکنش دارای یک ونیم میلی مولار منیزیم کلرید و دودهم میلی مولارdntpsو دوازده و نیم میکرولیتر بافر PCR تهیه شده واکنش PCR در حجم بیست وپنج میکرولیتر با مخلوط واکنش فوق به همراه با یک واحد آنزیم Taq DNA POLYMERAZE - از شرکت کوثر ایران - نیم میکرو مولار از هریک از پرایمرها در 2 میلیگرم از ژنوم باکتری مشکوک انجام شد.
برنامه ی PCR شامل این مراحل بود یک مرحله برداشت اولیه در 94 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه ،35 چرخه تکثیر DNA با شرایط واسرشت در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه ، مرحله اتصال در 61درجه به مدت یک دقیقه و تکثیر با دمای72 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه و نهایتا یک مرحله تکثیر نهایی در هفتادو دو درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه پس از اتمام واکنش تکثیر 5میکرولیتر محصول واکنش را به همراه یک میکرولیتر بافر لودینگ بر روی ژل آگاروز 2 درصد تحت تاثیر ولتاژ صد ولت الکترفورز گردید. ژن درنهایت در زیر دستگاه ترانس لومیناتور قرائت گردید.
