بخشی از مقاله
روش شناسائي يرسينيا انتروكلي تيكا در مواد غذائي
-0 مقدمه
جنس يرسينيا با پذيرفتن نامهاي متعددي چون فلاوباكتريوم پسودومولئي، باكتريوم انتروكلي تيكا، پاستور لاپسودوتوبركلوزيس، پاستور X و ژرم X نهايتا از سال 1974 از خانواده پاستور لاسه جدا و به همراه سه گونه اصلي يرسينياپستيس، يرسينيا پسودوتوبركلوزيس و يرسينيا انتروكلي تيكا بطور قطعي در خانواده آنتروباكتريا سه جاي گرفت.
اين باكتريها از جمله بيماري زاهاي مشترك انسان و دام هستند و مهم ترين گونهاي كه نقش آن در بيماري زايي انسان از سال 1965 به اثبات رسيده است يرسينيا انتروكلي تيكا ميباشد، شير خام، گوشت، سبزيجات و آب ميتواند بعنوان منبع آلودگي اين باكتري مطرح باشد.
يرسينيا انتروكلي تيكا ميتواند عامل بيماري معدي رودهاي، آدنيت مزانتريك، اريتم گرهدار عفونت خوني و پلي آرتريت باشد. اين ارگانيسم، كوكو باسيلي است گرم منفي، بدون كپسول، بيهوازي اختياري بطول 1-3 ميكرومتر و عرض 0/5 - 0/8 ميكرومتر كه حركت آن فقط در دماي پائين تر از 30 درجه سلسيوس به كمك فلاژلهاي پيراموني صورت ميگيرد. دماي مناسب رشد آن 28-29 درجه سلسيوس PH مناسب آن 7/2 - 7/4 است و مانند اكثر آنتروباكترياسهها گلوكز را بدون گاز تخمير ميكند و اكسيداز منفي است.
سروتيپهاي جديدي چون 0:13a; 13b, 0:4,32, 0:5,27, 0:21 بيماريزا تشخيص داده شدهاند.
بيشترين سروتيپهاي بيماريزا 0:3 0:8, 0:9 ميباشد.
از نظر سرولوژي آگلوتيناسيونهاي متقاطع با ارگانيسمهايي مانند سالمونلا، بروسلا، شيگلا، اشري شياكلي و ويبربو گزارش شده است.
1 ـ هدف و دامنه كاربرد
هدف از تدوين اين استاندارد ارائه روش جداسازي و شناسايي يرسينيا انتروكلي تيكاي بيماري زا براي انسان است . اين روش در مورد فرآوردههاي غذايي انسان و دام كاربرد دارد . 2 ـ واژهها و تعاريف در اين استاندارد واژهها با تعاريف زير بكار ميروند :
هدف از تدوين اين استاندارد ارائه روش جداسازي و شناسايي يرسينيا انتروكلي تيكاي بيماري زا براي انسان است . اين روش در مورد فرآوردههاي غذايي انسان و دام كاربرد دارد .
2 ـ واژهها و تعاريف
در اين استاندارد واژهها با تعاريف زير بكار ميروند : 2 ـ 1 ـ يرسينيا آنتروكلي تيكاي بيماري زا باكتريهاي سرما گرايي هستند كه اگر طبق روش مشروح در اين استاندارد آزمايش شوند روي محيط هاي جامد انتخابي پرگنههاي ويژهاي ايجاد مينمايند كه از نظر خواص بيوشيميايي با معيارهايي بيماري زائي اين استاندارد مطابقت ميكند .
در اين استاندارد واژهها با تعاريف زير بكار ميروند :
2 ـ 1 ـ يرسينيا آنتروكلي تيكاي بيماري زا
باكتريهاي سرما گرايي هستند كه اگر طبق روش مشروح در اين استاندارد آزمايش شوند روي محيط هاي جامد انتخابي پرگنههاي ويژهاي ايجاد مينمايند كه از نظر خواص بيوشيميايي با معيارهايي بيماري زائي اين استاندارد مطابقت ميكند .
2 ـ 2 ـ شناسايي يرسينيا آنتروكلي تيكا
شامل حضور يا عدم حضور اين باكتري در مقدار معيني از فرآورده غذايي است كه بر طبق روش مشروح در اين استاندارد تعيين ميشود .
3 ـ اساس آزمايش
شناسايي يرسينيا آنتروكلي تيكاي احتمالا بيماري زا در طي سه مرحله پي در پي زير صورت ميگيرد . 3 ـ 1 ـ غني سازي در محيط مايع انتخابي 3 ـ 1 ـ 1 ـ كشت نمونه مورد آزمون در دو محيط غني كننده زير :
شناسايي يرسينيا آنتروكلي تيكاي احتمالا بيماري زا در طي سه مرحله پي در پي زير صورت ميگيرد .
3 ـ 1 ـ غني سازي در محيط مايع انتخابي
3 ـ 1 ـ 1 ـ كشت نمونه مورد آزمون در دو محيط غني كننده زير :
الف آبگوشت نمك هاي صفراوي و سوربيتول و پپتن
Peptone Sorbitol and Bile salts Broth (PSB )
ب : آبگوشت ايرگازان ـ تيكارسيلين وكلرات پتاسيم
Jrgasan ticarcillin and Potassium chlorate broth (ITC)
3 ـ 1 ـ 2 ـ گرمخانه گذاري
كشت (PSB) در دماي 25 ـ 22 درجه سلسيوس بمدت 3 تا 5 روز
كشت (ITC) در دماي 25 ـ 22 درجه سلسيوس بمدت 2 روز (48 ساعت )
3 ـ 2 ـ كشت در محيطهاي جامد
كشت سطحي از محيطهاي PSB.ITC بترتيب در محيطهاي جامد زير :
3 ـ 2 ـ 1 ـ محيط سفسولودين ـ ايرگازان و نووبيوسين آگار
Cefsulodin Irgasan and novobiocin agar (CIN)
3 ـ 2 ـ 2 ـ محيط سالمونلا ـ شيگلا آگار حاي ذركسي كلات سديم و كلرور كلسيم
Salmonella / Shigella agar with Sodium desoxychlate and Calcium chloride (SSDC)
3 ـ 2 ـ 3 ـ گرمخانه گذاري
محيطهاي CIn و SSDC در دماي 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد . پس از 24 ساعت و در صورت لزوم پس از 48 ساعت متناسب با محيط , كشت ها را به منظور حضور پرگنه هاي ويژه يرسينيا آنتروكلي تيكا بررسي كنيد .
3 ـ 3 ـ تاييد
در اين مرحله روي پرگنههاي مشكوك به يرسينيا آزمايشهاي بيوشيميايي , آزمايش هاي خاص منطبق با معيارهاي بيماري زايي و در صورت امكان آزمايش هاي سرولوژيكي براي تاييد انجام ميشود .
به راهنماي روش كار مراجعه شود .
4 ـ محيطهاي كشت ومعرف هاي لازم
4 ـ 1 ـ كليات بدليل تعداد زياد محيطهاي كشت و معرفها و براي وضوح شرح آزمايش , تركيبات محيطها , جزييات مربوط به تقسيم و نگهداري آنها به صورت پيوست در استاندارد آمده است . 4 ـ 2 ـ محيطهاي غني كننده
4 ـ 1 ـ كليات
بدليل تعداد زياد محيطهاي كشت و معرفها و براي وضوح شرح آزمايش , تركيبات محيطها , جزييات مربوط به تقسيم و نگهداري آنها به صورت پيوست در استاندارد آمده است .
4 ـ 2 ـ محيطهاي غني كننده
4 ـ 2 ـ 1 ـ محيط مايع حاوي پيتن , سوربيتول و نمكهاي صفرا (PSB)
4 ـ 2 ـ 2 محيط مايع حاوي ايرگازان ـ تيكارسيلين وكلرات پتاسيم (ITC)
4 ـ 3 ـ محيطهاي كشت
4 ـ 3 ـ 1 ـ سفسولودين ـ ايرگازان و نووبيوسين حاوي آگار (CIN)
4 ـ 3 ـ 2 ـ سالمونلا ـ شيگلا آگار حاوي ذركسي كلات سديم و كلرور سديم (SSDC)
4 ـ 3 ـ 3 ـ نوترنيت آگار
4 ـ 4 ـ محيط هاي شناسايي ومعرفها
4 ـ 4 ـ 1 ـ محيط كشت اوره تريپتوفان
4 ـ 4 ـ 2 ـ معرف شناسايي تريپتوفان دي آميناز
4 ـ 4 ـ 3 ـ كليگر آگار
4 ـ 4 ـ 4 ـ معرف تشخيص اكسيداز
4 ـ 4 ـ 5 ـ محيط هاي كشت دكربوكسيلاز
4 ـ 4 ـ 5 ـ 1 ـ محيط كشت لايزين دكربوكسيلاز
4 ـ 4 ـ 5 ـ 2 ـ محيط كشت اورني تين دكربوكسيلاز
4 ـ 4 ـ 6 ـ محيط براي تخمير قندها ( ساكارز ( رامنوز يا ساليسين )
4 ـ 4 ـ 7 ـ محيط سيمون سيترات
4 ـ 4 ـ 8 ـمحيط صفرا و اسكولين آگاردار
4 ـ 4 ـ 9 كازئين سويا اگاردار
4 ـ 4 ـ 10 ـ كارتين سويا آگار دار براي شناسايي آميداز
4 ـ 4 ـ 11 ـ محلول سولفات آمونيوم و آهن دو ظرفيتي براي شناسايي پيرازين آميداز
مازئين سويا آگاردار حاوي منيزيم وآگزالات
4 ـ 5 ـ سرم فيزيولوژي
4 ـ 6 ـ پتاسيم هيدروكسايد در سرم فيزيولوژي
4 ـ 7 ـ محيط SIM آگار
5 ـ وسايل ضروري
يادآوري : بجاي ظرف شيشهاي چند بار مصرف از وسايل يكبار مصرف بشرط دارابودن ويژگيهاي مناسب ميتوان استفاده كرد. . 5 ـ 1 ـ وسيله سترون كردن خشك ( آون ) يا سترون كردن مرطوب ( اتوكلاو ) 5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظيم در 22±1درجه سلسيوس و 25±1درجه سلسيوس.
يادآوري : بجاي ظرف شيشهاي چند بار مصرف از وسايل يكبار مصرف بشرط دارابودن ويژگيهاي مناسب ميتوان استفاده كرد. .
5 ـ 1 ـ وسيله سترون كردن خشك ( آون ) يا سترون كردن مرطوب ( اتوكلاو )
5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظيم در 22±1درجه سلسيوس و 25±1درجه سلسيوس.
5 ـ 3 ـ قفسه خشك كردن يا آون داراي تهويه هوا با جابجايي و قابل تنظيم در 37±1 درجه و 55±1 درجه سلسيوس
5 ـ 4 ـ حمام آب قابل تنظيم در دماي 45±0/5درجه سلسيوس و 50±0/5درجه سلسيوس
5 ـ 5 ـ لولههاي آزمون با ابعاد 180*18 و 180*9 و 50*12 ميلي متر
5 ـ 6 ـ ظروف شيشه اي و بطري هاي با گنجايش مناسب
5 ـ 7 ـ ظروف پتري شيشهاي يا پلاستيكي بقطر 100 ـ 90 ميلي متر
5 ـ 8 ـ پي پتهاي 1 و 10 ميلي ليتري با درجه بندي 0/1 ميلي ليتر
5 ـ 9 ـ مكندههاي لاستيگي ( پوآر ) مخصوص پي پت
5 ـ 10 ـ حلقه كشت بقطر تقريبي 3 ميلي متر و سوزن كشت سر صاف از جنس پلاتين / ايريدوم يا نيكل / كروم و يا پي پت پاستور شيشهاي بجاي سوزن كشت .
يادآوري : حلقه و سوزن كشت يكبار مصرف ميتواند استفاده شود حلقه كشت از جنس نيكل / كرم براي انجام آزمون اكسيداز مناسب نيست .
5 ـ 11 ـ PH متر بادقت ±0/1 واحد PH در 25 درجه سلسيوس
5 ـ 12 ـ منبع نور مناسب براي تابش مورب
5 ـ 13 ـ ذره بين يا ميكروسكوپ
5 ـ 14 ـ مخلوط كن ( استوماكر )
6 ـ نمونه برداري
نمونه برداري از فرآورده بايد با رعايت اصول مربوط به نمونه برداري فرآورده غذايي براي آزمايشهاي ميكربي صورت گيرد . نمونهاي كه به آزمايشگاه ميرسد بايد معرف واقعي كالا بوده و در حين نمونه برداري و حمل و نقل دچار آسيب ديدگي و تغيير نشده باشد . 7 ـ آماده كردن نمونه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملي شماره 356 ايران (( آماده كردن نمونه غذايي و تهيه رقم اعشاري نمونه براي آزمايش هاي ميكربي )) آماده شود .
نمونه برداري از فرآورده بايد با رعايت اصول مربوط به نمونه برداري فرآورده غذايي براي آزمايشهاي ميكربي صورت گيرد . نمونهاي كه به آزمايشگاه ميرسد بايد معرف واقعي كالا بوده و در حين نمونه برداري و حمل و نقل دچار آسيب ديدگي و تغيير نشده باشد .
7 ـ آماده كردن نمونه
نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملي شماره 356 ايران (( آماده كردن نمونه غذايي و تهيه رقم اعشاري نمونه براي آزمايش هاي ميكربي )) آماده شود . 8 ـ روش آزمايش 8 ـ 1 ـ سوسپانسيونهاي اوليه
نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملي شماره 356 ايران (( آماده كردن نمونه غذايي و تهيه رقم اعشاري نمونه براي آزمايش هاي ميكربي )) آماده شود .
8 ـ روش آزمايش
8 ـ 1 ـ سوسپانسيونهاي اوليه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معيني ( وزن ي حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمايش را به حجم مشخصي از محيط PSB منتقل كنيد بطوري كه رقت يكدهم وزن به حجم يا حجم به حجم بدست آيد و بعد با استوماكر آن را مخلوط كنيد تا يكنواخت شود . 8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسيون ديگري از نمونه , با محيط ITC با رقت وزن به حجم يا حجم به حجم تهيه كنيد .
8 ـ 1 ـ سوسپانسيونهاي اوليه
8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معيني ( وزن ي حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمايش را به حجم مشخصي از محيط PSB منتقل كنيد بطوري كه رقت يكدهم وزن به حجم يا حجم به حجم بدست آيد و بعد با استوماكر آن را مخلوط كنيد تا يكنواخت شود .
8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسيون ديگري از نمونه , با محيط ITC با رقت وزن به حجم يا حجم به حجم تهيه كنيد .
8 ـ 2 ـ غني سازي 1
8 ـ 2 ـ 1 ـ محيط PSB كشت شده را در 25 ـ 22 درجه سلسيوس بمدت 5 روز بدون هم زدن و 2 تا 3 روز با هم زدن قرار دهيد .
8 ـ 2 ـ 2 ـ محيط ITC كشت شده را در 25 درجه سلسيوس براي 2 ورز (
48 ساعت ) گرمخانه گذاري كنيد .
8 ـ 3 ـ كشت
8 ـ 3 ـ 1 ـ با حلقه كشت از محيط (PSB) برداريد و روي محيط جامد (CIN) طوري كشت دهيد كه پرگنه هاي مجزا حاصل شود .
8 ـ 3 ـ 2 ـ با پي پت سترون , 0/5 ميلي ليتر از كشت PSB را به 4/5 ميلي ليتر
محلول پتاسيم هيدروكسايد ( محيط شماره 20 پيوست ) بيفزاييد و خوب مخلوط كنيد و بعد از 20 ثانيه با حلقه كشت از ان برداريد و در سطح محيط (CIN) طوري كشت دهيد كه پرگنههاي مجزا حاصل شود .
8 ـ 3 ـ 3 ـ با حلقه كشت از ITC كشت شده برداريد و در سطح جامد SSDC براي حصول پرگنههاي مجزا كشت دهيد .
8 ـ 3 ـ 4 ـ ظروف پتري بندهاي 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 ـ و 8 ـ 3 ـ 3 را بطور وارونه در گرمخانه در دماي 30 درجه سلسيوس براي 24 ساعت قرار دهيد .
8 ـ 3 ـ 5 ـ ظروف پتري را از گرمخانه خارج و آنها را به منظور شناسايي پرگنه هاي ويژه يرسينيا آنتروكلي تيكا در نور مايل (45 درجه ) با ذره بين بررسي كنيد .
الف - پرگنه هاي يرسينيا آنتروكلي تيكا در محيط CIN
كوچك ( برابر يا كوچكتر از يك ميلي متر ) صاف يا مركز قرمز و حاشيه شفاف و در زير نور مايل با ظاهري گرانول دار ريز و بدون قوس و قزح است .
ب - پرگنههاي يرسينيا آنتروكلي تيكا در محيط SSDC
كوچك ( برابر يا كوچكتر از يك ميلي متر ) خاكستري رنك يا حاشيه نامشخص و در زير نور مايل با ظاهري دانه دار و ريز و بدون قوس و قزح است
8 ـ 3 ـ 6 ـ اگر پرگنه هاي يرسينياريز و يا كمرنگ باشند و يا ديده نشوند ظروف پتري را براي 24 ساعت ديگر گرمخانه گذاري كنيد .
8 ـ 3 ـ 7 ـ انتخاب پرگنهها
از هر ظرف پتري هر يك از محيطهاي انتخابي بند 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 و 8 ـ 3 ـ 3, 5 پرگنه مشكوك برداريد . اگر در يك ظرف 5 پرگنه مشكوك يا كمتر وجود داشت تمام آنها را براي تاييد برداريد .
8 ـ 3 ـ 8 ـ جدا سازي پرگنهها
پرگنههاي انتخاب شده را روي محيط نوتر نيت آگار ( محيط شماره 5 پيوست ) كشت خطي دهيد و سپس ظروف پتري را براي 24 ساعت و در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد . پس از اين مدت ظروف از گرمخانه خارج و آنها را در دماي ( 5 ـ 0) درجه سلسيوس ( دماي يخچال ) براي آزمايشهاي تاييدي و بيماري زايي نگهداري كنيد .
9 ـ آزمايش هاي بيو شيميايي
از كشت هاي خالص براي آزمايش هاي زير استفاده ميشود . 9 ـ 1 ـ آزمايش هاي تشخيص بيو شيميايي 9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمايش اوره از
از كشت هاي خالص براي آزمايش هاي زير استفاده ميشود .
9 ـ 1 ـ آزمايش هاي تشخيص بيو شيميايي
9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمايش اوره از
با ميله شيشهاي يا سوزن كشت از پرگنههاي مجزا شده در محيط نوترنيت آگار برداريدو بطور دقيق زير محيط مايع اوره ترپيتوفان ( محيط شماره 6 پيوست ) كشت دهيد و براي 24 ساعت در دماي 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .
نتيجه ـ رنگ صورتي بنفش نشان دهنده واكنش مثبت اوره آز است .
رنگ زرد نارنجي نشان دهنده واكنش اوره از است .
9 ـ 1 ـ 2 ـ آزمايش تريپتوفان دي آميناز
سه قطره ازمعرف شناسايي تريپتوفان دي آميناز ( شماره 7 پيوست ) را به كشت حاصل از بند 9 ـ 1 ـ 1 بيفزاييد .
نتيجه : رنگ قهوهاي نشان دهنده واكنش مثبت است .
9 ـ 1 ـ 3 ـ كليگلر آگار
از پرگنههاي خالص شده روي نوترينت آگار برداشته و در سطح محيط مورب كليگلر آگار ( شماره 8 پيوست ) بطور خطي كشت دهيد و بعد سوزن را به عمق محيط فرو بريد . سپس آن را در دماي 30 درجه سلسيوس براي 24 ساعت تا 48 ساعت گرمخانه گذاري كنيد و . سپس تغييرات حاصله در محيط را بشرح زير مورد بررسي قرار دهيد و نتيجهگيري كنيد .
9 ـ 1 ـ 4 آزمايش اكسيداز
با ميله شيشهاي قسمتي از پرگنه مجزا و خالص يرسينيا را برداريد و روي يك كاغذ صافي مرطوب شده با معرف اكسيداز ( شماره 9 پيوست ) يا روي ديسك قابل دسترس تجارتي تماس دهيد ( از سوزن كشت يا حلقه كشت نيكل / كروم براي اين منظور استفاده نشود).
نتيجه : چنانچه رنگ كاغذ صافي در مدت 10 ثانيه ارغواني روشن , بنفش و يا آبي تيره نشود آزمايش اكسيداز منفي است .
توجه ـ علاوه بر آزمايشهاي بيوشيميايي فوق از آزمون حركت نيز جهت تشخيص يرسينيا ميتوان استفاده كرد .
9 ـ 1 ـ 5 ـ آزمايش حركت
از پرگنه هاي مجزا و خالص يريسنيا برداريد و بطور عمودي در دو لوله محتوي محيط SIM آگار ( شماره 21 پيوست ) فرو بريد و يكي از دو لوله را در 25 درجه و ديگري را در 37 درجه سلسيوس براي 24 ساعت گرمخانه گذاري كنيد و پس از اين مدت آنها را بررسي كني
د .
نتيجه : در صورتي كه باكتري در محيط كشت به طرفين انتشار يافته باشد و كدورت در آن منطقه حاصل شده باشد آزمايش حركت مثبت است .
9 ـ 1 ـ 6 ـ انتخاب پرگنهها
پرگنه هايي كه خصوصيات مندرج در جدول شماره يك را دارا هستند براي آزمايشهاي تاييدي انتخاب شوند .
(1) – سويه هاي اوره آز منفي از يرسينيا انتروكلي تيكا گزارش شده اند كه بيماري زا نيستند .
(2) – در موقع تشكيل گاز از گلوكز ممكن است كمي حباب هوا ايجاد شود اگر چه يرسينيا معمولا قندها را بدون ايجاد گاز تخمير ميكند ولي بعضي از سويه هاي يرسينيا ( بيووار 3 ) ممكن است يك يا دو حباب ايجاد كند ( ايجاد گاز ضعيف )
(3) – برخي از سويه هاي يرسينيا انتروكلي تيكا لاكتوز + از فراوره هاي لبني جدا شده اند كه معمولا بيماري زا نيستند .
9 ـ 2 ـ آزمايشهاي تاييدي بيوشيميايي
9 ـ 2 ـ 1 ـ آزمايش لايزين دكربوكسيلاز
با سوزن با حلقه كشت يا ميله شيشهاي از پرگنه هايي مجزا و خالص شده روي نوترنيت آگار برداريد و در محيط لايزين دكربوكسيلاز ( شماره 10 پيوست ) كشت دهيد و براي 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .
نتيجه : پيدايش رنگ بنفش در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش مثبت است و پيدايش رنگ زرد در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش منفي است .
9 ـ 2 ـ 2 ـ آزمايش اورني تين دكربوكسيلاز
از پرگنههاي خالص برداريد و در محيط اورني تين ( شماره 11 پيوست ) كشت دهيد و 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .
نتيجه : پيدايش رنگ بنفش پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش مثبت است و پيدايش رنگ زرد در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش منفي است .
9 ـ 2 ـ 3 ـ تخمير ساكارز و رامنوز
از پرگنه هيا خالص برداريد و در محيطهاي قندي مايع ( شماره 12 پيوست ) كشت دهيد و براي 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .
نتيجه : پيدايش رنگ زرد پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش مثبت است و پيدايش رنگ قرمز پس ازگرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش منفي است .
9 ـ 2 ـ 4 ـ هيدروليز سيترات
از پرگنههاي خالص يرسينيا برداريد و در سطح مورب محيط سيمون سيترات ( شماره 13 پيوست ) كشت دهيد و آن را براي 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .
نتيجه : پيدايش رنگ آبي در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده و
اكنش مثبت است و اگر در محيط تغيير رنگ ايجاد نشود هيدروليز سيترات منفي است .
9 ـ 3 ـ آزمايشهاي تاييدي بيماري زائي