بخشی از مقاله
چکیده:
انواع مختلفی از میکروب ها را می توان عامل ایجاد مسمومیت هاي غذایی با علائم التهاب هاي معده اي _ روده اي دانست. از آن جمله می توان باکتري هاي استافیلو کوکی ها، باکتري هاي اسپورزاي گرم مثبت مانند یرسینیا و کمپیلو باکتر ها را نام برد که در این تحقیق با هدف تعیین شیوع کمپیلو باکتر کلی، کمپیلو باکتر ژژونی و یرسینیا انتروکولیتیکا از شیر و فراورده هاي شیري در اصفهان انجام شده است. در فاصله زمانی تیر1390 تا تیر ماه سال1391، از مناطق مختلف استان اصفهان 360 نمونه شامل شیر خام و فرآورده هاي آن به طور تصادفی جمع آوري گردید.
تمامی نمونهها از نظر وجود کمپیلوباکتر و یرسینیا به روش استاندارد مورد آزمایش قرار گرفتند. به منظور استخراج DNA از باکتري هاي مورد مطالعه از روش جوشاندن - - Boiling استفاده شد.به طور کلی شیوع کمپیلوباکتر درکل نمونه هاي سنتی و صنعتی مورد مطالعه با روش واکنش زنجیره اي پلی مراز 10 درصد و شیوع یرسینیا انتروکولیتیکا 19 درصد به دست آمد. نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر نشان داد شیر خام داراي بیش ترین میزان آلودگی به کمپیلوباکتر و یرسینیا انتروکولیتیکا در مقایسه با سایر فراورده هاي شیري را داشته است.
مقدمه:
کمپیلوباکترها از خانواده کمپیلوباکتریاسه با خاصیت رشد میکروآئورفیلیک می باشند، گرم منفی، باریک و به شکل میله هاي مارپیچی شکل بوده که داراي 17 گونه می باشند 7 - و. - 9 که کمپیلو باکتر ژوژنی و کمپیلوباکتر کلی از مهمترین شاخص هاي ایمنی مواد غذایی و عامل بالقوه کمپیلوباکتریوزیس در انسان می باشند 1 - و. - 3 کمپیلو باکتریوزیس یک بیماري مشترك بین انسان و دام است و غذا به عنوان مهم ترین منبع آلودکی محسوب می شود که بیش تر ناشی از مصرف گوشت و فراورده هاي طیور می باشد هر چند که گوشت سایر انواع دام ها ،شیر و فراورده هاي آن از دیگر منابع این پاتوژن می باشند.
- 4 - یکی از منابع شیوع این عفونت شیر گاو غیر پاستوریزه یا شیري که به طور ناقص پاستوریزه شده است که حضور این میکروب در شیر خام عمدتا در اثر آلودگی آن با مدفوع در خلال شیردوشی و یا عفونت پستان می باشد 4 - و. - 5 یرسینیاانتروکولیتیکا باسیلی گرم منفی کوتاه و بدون اسپور، سرمادوست و متحرك می باشد. یکی از مهم ترین راه هاي انتقال این پاتوژن به انسان از طریق مصرف شیر خام و فراورده هاي آن است 2 - و. - 3 در این تحقیق هیچ گونه کمپیلو باکتري از 15 شیر پاستوریزه و از 64 فراورده صنعتی آن جدا نگردید ولی از 281 نمونه شیر خام و فراورده هاي سنتی 8 گونه جدا گردید . این نتیجه با نتیجه گزارش شده توسط EI-Sharoud از مصر - 2009 - و - 2010 - Salihu از نیجریه و Whyte از ایرلند مطابقت دارد.
همچنین براساس نتایج بدست آمده در این مطالعه از مجموع 360 نمونه بررسی شده 20نمونه 5/6 - درصد - آلوده به یرسینیا انتروکولیتیکا تشخیص داده شدکه این نتیجه با نتیجه گزارش شده توسط آقاي Vidoni و همکارش که به منظورجداسازي یرسینیا انتروکولیتیکا به 3روش در فرانسه انجام شد و نشان دادند از 75 نمونه شیر خام عرضه شده 61 نمونه 81/4 - درصد - واجد یرسینیا انتروکولیتیکا می باشد مطابقت دارد . - 11 -
مواد و روش ها:
در این بررسی360نمونه شامل شیر خام 150 - نمونه - ، شیر پاستوریزه - 15 - ، کره سنتی - 20 نمونه - ،کره صنعتی - 10 - ، بستنی سنتی - 25 نمونه - ، بستنی صنعتی - 10 - ، پنیر سنتی 40 - نمونه - ، پنیر صنعتی - 20 - ، ماست سنتی - 13 - ، ماست صنعتی - 7 - ، دوغ سنتی 13 - - ، دوغ صنعتی - 7 - ، کشک سنتی - 20 - ، کشک صنعتی - - 10 را از استان اصفهان به طور تصادفی جمع آوري شد و در ظروف استریل و در کنار یخ به آزمایشگاه انتقال داده شد جهت جدا سازي گونه هاي کمپیلوباکتر از هر نمونه هموژن 5 گرم به 45 میلی لیتر آبگوشت غنی کننده کمپیلوباکتر غنی شده با مکمل انتخابی کمپیلوباکتر و 25 میلی لیتر خون دفیبرینه گوسفند براي هر 475 میلی لیتر محیط اضافه ، سپس این لوله ها در دماي 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاري شد.
پس از این مدت 0/1 میلی لیتر از آن با روش خطی برروي محیط کشت انتخابی کمپیلوباکتر غنی شده با مکمل آنتی بیوتیکی و 5 درصد خون دفیبرینه گوسفند - Campylobacter selective agar - کشت داده شد و براي48- 72 ساعت در داخل انکوباتور CO2 دار قرارگرفت . پس از طی زمان مورد نظر پلیت ها از نظر حضور پرگنه هاي مسطح و غیر همولیتیک و خاکستري رنگ به قطر حدود 1 میلی لیتر ، مدور و آبکی مورد بررسی قرار گرفتند و پرگنه هاي داراي این مشخصات براي ادامه کار انتخاب شدند.
سپس رنگ آمیزي گرم انجام شد.در این مرحله پرگنه هاي حاوي باسیل هاي گرم منفی ، کشیده و فنري شکل براي ادامه کار انتخاب و آزمایش کاتالاز را انجام دادیم وکاتالاز مثبت ها را انتخاب کردیم. جهت تشخیص تفریقی کمپیلو باکتر ژژونی از کمپیلوباکتر کلی از آزمایش هیدرولیز هیپورات استفاده کردیم نمونه هاي داراي رسوب به عنوان گونه کمپیلو باکتر ژژونی تلقی شدند و گونه کمپیلو باکتر کلی قادر به هیدرولیز نبود. جهت تائید نهایی گونه هاي کمپیلوباکتر ژژونی وکمپیلوباکتر کلی از روش PCR استفاده شد.
براي جداسازي یرسینا انتروکولیتیکا 5 گرم از هر نمونه هموژن شده در محیط آبگوشت غنی کننده یرسینیا کشت و به مدت48ساعت در دماي 29 درجه سلسیوس گرم خانه گذاري گردید. در مرحله بعد از محیط غنی کننده، باکتري درمحیط جامد انتخابی یرسینیا به همراه مکمل هاي آنتی بیوتیکی کشت و به مدت 24ساعت در گرمخانه 37 درجه قرارگرفت. پس از 24 ساعت پرگنه هاي قرمز با مرکز تیره ترو حاشیه شفاف با قطر حدود./5 تا 2 سانتی متر به عنوان پرگنه هاي مشکوك به یرسینیا انتخاب شدند. پس از انجام رنگ آمیزي گرم روي پرگنه هاي مشکوك ومشاهده باسیل هاي کوچک گرم منفی در آنها آزمایش هاي تفریقی نظیر لیزین دکربوکسیلازو اورنیتین و دکربوکسیلاز، اوره، سیترات و تخمیر قند هاي مانیتول، مانوز، رامنوز، لاکتوزو سوکروز جهت تایید یرسینیا انتروکولیتیکا انجام گردید. سپس به منظور تشخیص قطعی این میکروب از روش PCR استفاده شد.
نتایج و بحث:
در این مطالعه مجموعا 360 نمونه از انواع شیر و فراورده هاي سنتی و صنعتی آن از نظر آلودگی به گونه هاي کمپیلوباکتر شامل کمپیلو باکتر ژژونی، کمپیلو باکتر کلی، و یرسینیا انتروکولیتیکا مورد آزمایش قرار گرفتند. بر اساس آزمون کشت و آزمایشات بیوشیمیایی 14 نمونه از مجموع 360 نمونه 3/9 - درصد - انواع شیر و فراورده هاي آن مورد مطالعه حامل گونه هاي کمپیلو باکتر بودند.از بین انواع نمونه هاي مورد مطالعه بر پایه آزمون کشت و آزمایشات بیوشیمیایی هیچ یک از نمونه هاي شیر شتر، شیر پاستوریزه، فراورده هاي صنعتی، ماست، دوغ، کشک، به گونه هاي کمپیلوباکتر آلوده نبوده اند.
در مقابل 5 نمونه از 50 نمونه شیر گاو - 10 درصد - ، 2 نمونه از 40 نمونه شیر گوسفند 5 - درصد - ، 1 نمونه از 40 نمونه شیر بز 2/5 - درصد - ، 4 نمونه از 60 نمونه پنیر 6/6 - درصد - ، 1 نمونه از 35 نمونه بستنی 2/8 - درصد - ، 1 نمونه از 30 نمونه کره 3/3 - درصد - حامل یکی از گونه هاي کمپیلوباکتر بوده اند. بررسی 14 گونه کمپیلوباکتر جدا شده از نمونه هاي مورد مطالعه بر پایه آزمون واکنش زنجیره پلی مراز نشان داد که از بین 14 گونه کمپیلو باکتر جدا شده تنها 8 گونه 2/2 - درصد - مورد تایید قرار گرفتند و 6 گونه دیگر مورد تایید واقع نشد. از بین انواع نمونه هاي مورد مطالعه بر پایه آزمون واکنش زنجیره پلی مراز هیچ یک از نمونه هاي شیر شتر، شیر پاستوریزه، فراورده هاي صنعتی، ماست، دوغ، کشک، به گونه یرسینیا آلوده نبوده اند.
در مقابل 3 نمونه از 50 نمونه شیر گاو 6 - درصد - ، 1 نمونه از 40 نمونه شیر گوسفند 2/5 - درصد - ، 1 نمونه از 40 نمونه شیر بز 2/5 - درصد - ، 2 نمونه از 60 نمونه پنیر 3/3 - درصد - ، 1 نمونه از 30 نمونه کره 3/3 - درصد - حامل یکی از گونه هاي کمپیلوباکتر بوده اند. بیشترین میزان شیوع گونه هاي کمپیلوباکتر جدا شده از نمونه ها کمپیلو باکتر ژژونی 1/6 - درصد - و مابقی کمپیلو باکتر کلی 0/5 - درصد - بوده است . همچنین میزان شیوع کمپیلوباکتر ژژونی در نمونه ها به ترتیب میزان آلودگی درنمونه هاي ، شیر خام گاو، کره، شیر خام گوسفند، شیر خام بز و پنیر 3،3/4، 2/5، 2/5، 1/66 درصد و میزان شیوع کمپیلوباکترکلی درنمونه هاي شیر خام گاو و پنیر 2، 1/66 درصد می باشند.
براساس نتایج بدست آمده در این مطالعه از مجموع 360 نمونه بررسی شده 20نمونه 5/6 - درصد - آلوده به یرسینیا انتروکولیتیکا تشخیص داده شد. بر پایه نتایج آزمون کشت: بالاترین میزان آلودگی به یرسینیا انتروکولیتیکا به ترتیب درنمونه هاي شیرخام گاو 16 - درصد - ، پنیر 11/7 - درصد - ، ، شیر خام گوسفند - 7/5 درصد - ، بستنی 2/9 - درصد - و شیر بز - 2/5 درصد - می باشد و بر پایه نتایج آزمون PCR بالاترین میزان آلودگی به ترتیب در نمونه هاي شیر خام گاو 12 - درصد - ، پنیر 10 - درصد - ، شیر خام گوسفند 7/5 - درصد - ، بستنی 2/9 - درصد - و شیر بز 2/5 - درصد - می باشد. در حالی که هیچ یک از نمونه هاي شیر پاستوریزه و شیر خام شتر و پنیر صنعتی و بستنی صنعتی و ماست و دوغ و کره و کشک به این پاتوژن آلوده نبودند. ارزیابی سوش هاي یرسینیا انتروکولیتیکا جدا شده از نمونه ها به کمک آزمون واکنش زنجیره اي پلی مراز نشان داد از بین 20سوش جدا شده 17 سوش یرسینیا انتروکولیتیکا بوده و 3 سوش تایید نشده است.
نتیجه گیري کلی:
در این تحقیق هیچ گونه کمپیلو باکتري از 15 شیر پاستوریزه و از 64 فراورده صنعتی آن جدا نگردید ولی از 281 نمونه شیر خام و فراورده هاي سنتی 8 گونه جدا گردید. این نتیجه با نتیجه گزارش شده توسط EI-Sharoud از مصر - 2009 - و - 2010 - Salihu از نیجریه و Whyte از ایرلند مطابقت دارد. در بین همه نمونه هاي شیرو فراورده هاي آن که در این تحقیق آزمایش شده است پنیرهاي سنتی تهیه شده از شیر خام گوسفند یا گاو بالاترین میزان شیوع کمپیلو باکتر را داشته است.اگر چه شیوع کمپیلو باکتر در فراورده هاي شیري مختلف دیده شده ولی متداولترین منبع شیوع آن در نمونه هاي شیر خام و پنیر هاي نرم می باشد 6 - و8و. - 10 همچنین در این تحقیق هیچ گونه یرسینیا انتروکولیتیکا از 15 شیر پاستوریزه و از 64 فراورده صنعتی آن جدا نگردید ولی از 281 نمونه شیر خام و فراورده هاي سنتی 17گونه جدا گردید.
در بین همه نمونه هاي شیرو فراورده هاي آن که در این تحقیق آزمایش شده است پنیرهاي سنتی تهیه شده از شیر خام گوسفند یا گاو بالاترین شیوع یرسینیا نسبت به سایر فراورده ها را داشته است.اگر چه شیوع یرسینیا در فراورده هاي شیري مختلف مانند شیر خام بز و یک مورد در بستنی دیده شده است ولی متداولترین منبع شیوع آن در نمونه هاي شیر خام و پنیر هاي نرم گزارش شده است 6 - و 8و. - 10 همچنین شایان ذکر است عدم وجود گونه هاي کمپیلو باکتر و یرسینیا در نمونه هاي ماست، دوغ، کشک و هم چنین شیوع کم آنهادر کره -1به خاطر اسیدي بودن این محصولات و -2 وجود مرحله جوشانیدن در طی فرایند تولید آن ها می باشد.
