بخشی از مقاله
چکیده:
باکتری لیستریامونوسیتوژنز کوکوباسیل،گرم مثبت غیرهاگ گذارمی باشد.میزان وپراکندگی این باکتری درطبیعت زیاداست.این باکتری درانسان وحیوان بیماریزااست وعوارض مختلفی راایجادمی کند.راه اصلی انتقال این باکتری به انسان ازطریق مصرف غذاهای آلوده است.مواد غذایی که به صورت خام مصرف می شوند مانند شیر خام، پنیر محلی،سالاد،مواد غذایی دریایی و مواد غذایی آماده مصرف از مهمترین عوامل شیوع بیماری لیستریوز در ارتباط با غذا می باشند.
در این بررسی تعداد 100 نمونه همبرگر از سطح مغازه های ساندویج فروشی شهر کرمان جمع آوری و در مجاورت یخ به آزمایشگاه انتقال یافت.کلنی های تیپیک جهت آزمایشات بیوشیمیایی مورد ارزیابی قرار گرفت.برای آزمایشات بیوشیمیایی از کیت میکروژن انگلستان استفاده گردید. سپس ژن های حدت iapوact A با روش مولتی پلکس PCRشناسایی گردید. از 100نمونه انتخاب شده فقط 2 مورد - %2 - لیستریا مونوسیتوژنز جدا گردید. برخی از یافته های محققین دیگر نیز فراوانی خیلی ناچیزی از آلودگی همبرگر به این باکتری را گزارش نموده اند.
مقدمه:
لیستریامونوسیتوژنزباکتری گرم مثبت،بدون اسپور،هوازی -بی هوازی اختیاری است که به صورت خارج سلولی وداخل سلولی قادربه رشدمی باشد. این باکتری مهمترین باکتری جنس خود به شمار می آیدودرمحیط گستردگی فراوان دارد.درخاک، آب، مدفوع انسان ودام،سبزیجات،گوشت خام سفید و قرمز،ماهی،فرآورده های گوشتی وشیریافت میشود.این باکتری در دام وانسان میتواند بیماریزا باشد - . - 5,13 توانایی رشد این باکتری در خشکی و سرما باعث افزایش بقاء و پراکندگی آن گشته است لذا به راحتی می تواند در مواد غذایی موجود در یخچال رشد نماید و حتی در عملیات ناقص پاستوریزاسیون باقیمانده وازبین نمیرود.
- . - 3 در دهه های اخیربه دنبال افزایش مصرف مواد غذایی آماده مصرف، لیستریا به عنوان یک پاتوژن مهم در صنایع غذایی مطرح شده است - . - 8 اولین شیوع غذایی لیستریا در سال 1981،محققین را وادار به جداسازی باکتری از مواد غذایی نمود - . - 7 لذا در انواع مواد غذاییآماده مصرف که بدون حرارت دادن مصرف می شوند یا قبل از پختن، سرد و ذخیره سازی شده و احتمالاً مجدداً آلودگی یافته یا به طور کامل پخته نشوند،خطر آلودگی به لیستریا وجود دارد.باکتری بر خلاف سایر عوامل بیماریزای غذازاد می تواند در دمای یخچال رشد کرده و محیط های نسبتاً اسیدی،کم رطوبت و دارای نمک زیاد را تحمل نموده و رشد کند.
- . - 14این باکتری بیماریزا اغلب در محیط تولید و فرآوری مواد غذایی با منشأ دامی در خاک، آب، بر روی دیوار، کف و وسایل وجود دارد - . - 2از جمله فاکتورهای حدت این باکتری وجود ژنی تحت عنوان act A به وزنbp400است که پلیمریزاسیون اکتین اسکلت سلولی میزبان را روی سطح باکتری توسعه می دهد - . - 9ژن دیگری تحت عنوان iap به وزن bp453 ، پروتئین P60 را کد می کند که وظیفه تهاجم سلولی را بر عهده دارد.از این دو ژن به طور اختصاصی برای تأئید تشخیص گونه های مختلف لیستریا مونوسیتوژنز استفاده می شود - . - 10,11افراد پیر و مسن و کسانی که سیستم ایمنی ضعیفی دارند، نوزادان وزنان بارداربهترین میزبانها برای رشد این باکتری هستند. این باکتری علائم متفاوتی در انسان و دام ایجاد میکند که شامل سقط جنین در زنان باردار، سپتی سمی نوزادان،عفونت داخل رحمی به صورت گرانولوماتوزیز،انسفالیت،مننگوانسفالیت،اندوکاردیت،میوکاردیت،نکروزکبدی وعوارض پوستی و گوارشی می باشد.
انتقال باکتری به انسان ازطریق خوردن شیر،گوشت، سبزیجات آلوده و فرآورده های گوشتی و شیری آلوده می باشد - . - 6,12 اگرچه میزان شیوع این بیماری کم است اما میزان مرگ و میر آن حدود 25-30 درصد می باشد - . - 9 روش PCR در تأیید تشخیص لیستریا مونوسیتوژنز مورد استفاده قرار گرفته است. حساسیت و اختصاصیت PCR بالا است و به خصوص زمانی کاربرد دارد که استفاده قبلی بیمار از آنتی بیوتیک ها حساسیت استفاده از روش کشت را پایین آورده باشد.برای این تشخیص از پرایمرهای ژن های حدت هدف استفاده می شود.تشخیص با استفاده از روش PCR مستقیم بعد از یک مرحله غنی سازی انتخابی به کار می رود و مشخص شده است که آزمایش مستقیم نمونه ها بدون استفاده از مواد غنی کننده نتایج قابل اعتمادی نخواهد داشت. - - 8
ژن iap یک پروتئین خارج سلولی تحت عنوان P60 را کد می کند که وظیفه تهاجم سلولی را بر عهده دارد.ژن actA پروتئین ActA را کد می نماید که فقط در غشاء سلولی گونه های لیستریا مونوسیتوژنز یافت می شود.این پروتئین پلیمریزاسیون اکتین را القا می کند که باکتری بتواند بین سلول های میزبان حرکت کند. اگر چه به صورت پراکنده در بعضی شهر های ایران تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته اما در شهر کرمان گزارشی وجود ندارد.هدف از این بررسی جداسازی و تعیین فراوانی لیستریا در همبرگر با استفاده از روش مولتی پلکس PCR می باشد.
موادوروشها:
در این بررسی تعداد 100 نمونه همبرگر از سطح مغازه های ساندویج فروشی شهر کرمان جمع آوری و در مجاورت یخ به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان انتقال یافت .ابتدا 10 گرم از نمونه ها توزین و به 90 سی سی محیط کشت غنی کننده لیستریا - LEB - منتقل گردید - . - 0HUN'*HUPDQ\مدت 48 تا 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد انکوبه شد سپس به محیط اختصاصی پالکام آگار حاوی مکمل آکسفورد منتقل گردید - . - +LPHGLD',QGLDجداسازی لیستریا در این محیط بر اساس هیدرولیز اسکولین و تخمیر مانیتول است.
گونه های لیستریا اسکولین را هیدرولیز می نمایند که محیط کشت را سیاه می کنند.این سیاه شدن به علت تشکیل 6و7 دی هیدروکسی کومارین است که با یون های آهنی که به صورت آمونیوم سیترات آهن در محیط کشت موجود است، واکنش می دهد.مانیتول و معرف فنل رد برای تفریق گونه های تخمیر کننده مانیتول از آلودگی های محتمل با انتروکوک ها و استافیلوکوک ها به محیط اضافه شده اند.گونه های لیستریا مانیتول را تخمیر نمی کنند که این با تغییر رنگ در کلنی و یا تغییر رنگ محیط اطراف کلنی از قرمز یا توسی به زرد مشخص می شود.
اساس کار بر پایه تولید فرآورده های اسیدی است، سپس ازتست های تأییدی کاتالاز و اکسیدازاستفاده گردید.جهت تست کاتالاز در کنار شعله با استفاده از لوپ استریل کلنی برداشت کرده روی قطره ای از پراکسید هیدروژن اضافه کرده، چنانچه باکتری کاتالاز مثبت باشد، تولید حباب می نماید.تست دیگر اکسیداز است که با استفاده از کیت تشخیصی انجام می شود.یک دیسک اکسیداز را روی لام قرار داده یک کلنی از باکتری تازه روی محیط بلاد به آن اضافه می کنیم، چنانچه باکتری اکسیداز مثبت باشد دیسک به بنفش تغییر رنگ می دهد.برای آزمایشات بیوشیمیایی از کیت میکروژن انگلستان استفاده گردید.سپس ژن های حدت iapوact A با روش مولتی پلکس PCRشناسایی گردید.
از پرایمرهای اصلاح شده توسط Manzano et al - 1998 - و Vazquez-Boland etal. - 1992 - در این بررسی استفاده گردید - . - 11ازتست های تأییدی انجام شده تست کاتالاز بود که در کنار شعله با استفاده از لوپ استریل کلنی برداشت کرده روی قطره ای از پراکسید هیدروژن که از قبل روی لام قرار داده شده،گذاشته شد.چنانچه باکتری مشکوک کاتالاز مثبت باشد،تولید حباب می نماید. جهت set upروش PCR از سوش استاندارد لیستریا مونوسیتوژنز ATCC 7644 استفاده شده است.
روش به کار رفته به این شرح است که از روش جوشاندن برای استخراج اسید نوکلئیک استفاده گردید. به این منظورابتدا 3 یا 4 کلنی خالص باکتری مورد نظر در یک میلی لیتر آب مقطر استریل یکنواخت شده و در دور 14000 g به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی را خارج نموده و با استفاده از 500 میکرولیتر محلول کلریدسدیم 0/85درصد رسوب ایجاد شده شستشو شد. دوباره عمل سانتریفیوژ صورت گرفته و محلول رویی را خارج نموده و رسوب ایجاد شده در 250میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد. سپس لوله ها را بمدت 10دقیقه در حرارت 100درجه قرار داده و بلافاصله در کنار یخ سرد شدند. محلول حاضر حاوی اسید نوکلئیک استخراج شده بود و جهت انجام آزمایش M-PCRمورد استفاده قرار گرفت.
تمامی موارد فوق در میکروتیوب های 0/2میلی لیتری ریخته شد و در زیر هود به هر کدام 10 میکرولیتر DNAالگو که قبلاً تهیه شده بود،اضافه گردیده کاملاً مخلوط شد.در نهایت نمونه به دستگاه ترمال سایکلر انتقال یافت که برنامه ریزی زیر به آن داده شده بود.دناتوراسیون اولیه نمونه ها در دمای 95 درجه سانتی گراد بمدت 5 دقیقه صورت گرفته و سپس 35 سیکل که یک سیکل آن شامل 1/5 دقیقه در 95 درجه سانتی گراد جهت دناتوراسیون، 80 ثانیه در 46 درجه به منظور اتصال پرایمرها و 2دقیقه در 72درجه به منظور تکثیر تکرار شد. در نهایت 7 دقیقه در 72درجه به منظور تکثیر نهایی قرار گرفت.در خاتمه 5 میکرولیتر از محصول PCR با 1 میکرولیتر بافر نمونه مخلوط نموده و در ژل آگارز %1/5 حاوی اتیدیوم برمید الکتروفورز شد.
نتایج:
در این مطالعه جداسازی باکتری از همبرگر مورد بررسی قرار گرفت. از 100نمونه انتخاب شده فقط 2 مورد لیستریا مونوسیتوژنز جدا گردیدکه با آزمایشات بیوشیمیایی و PCR موردتأییدقرارگرفت.شکل شماره 1 محصول PCRرا نشان می دهد. الکتروفورز محصول PCR باکتری استاندارد لیستریا مونوسیتوژنز - - ATCC 7644 :A نشانگر 50 جفت بازی، :B باکتری استاندارد، :C کنترل منفی
بحث:
باتوجه به مطالب فوق واطلاعات سازمان بهداشت جهانی درمورد این باکتری که میزان کشندگی آنرا 30درصد اعلام کرده است لذ ا بررسی میزان شیوع وفراوانی این باکتری بسیار مهم و حیاتی است . - 13 - در سال 1988 جانسون و سیراگوزا وجود لیستریامونوسیتوژنز را در گوشت فریز شده اثبات کردند و مشخص شد که نگهداری طولانی در فریزر نیز تأثیری در از بین بردن باکتری نداشته است . - 5 -
