بخشی از مقاله
چکیده
پروتئین هاي ناقل لیپید - Lipid Transfer Protein = LTP - ، پروتئین هاي کوچک با وزن مولکولی 7 تا 10 کیلودالتون می باشند که در مکانیسم دفاعی گیاهان مختلف، نقش ضد قارچی دارند. پروتئین هاي ضد قارچی به علت پتانسیل زیادشان در محافظت از محصولات در برابر تهاجم قارچ و در نتیجه اهمیتشان در اقتصاد مورد توجه هستند. در این تحقیق، جداسازي ژن ltp از ژنوم گیاه برنج و کلون کردن آن در وکتور بیانی و مطالعه بیان آن گزارش شده است. بدین منظور با طراحی پرایمرهاي مناسب، ژن ltp با استفاده از روش PCR از ژنوم گیاه برنج استخراج گردید. ژن استخراج شده با هظم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت.
سپس این ژن به درون وکتور بیانی pET-24 d - Novagen - همسانه سازي شد. سازه ي نوترکیب بدست آمده با نام pET-24FZ پس از انتقال به میزبان پروکاریوتی به کمک الگوي PCR با پرایمرهاي اختصاصی ژن و پرایمرهاي وکتور و نیز تعیین توالی مورد تایید قرار گرفت. القاي بیان پروتئین LTP با اضافه کردن IPTG در غلظت نهایی 1 mM به محیط کشت باکتري میزبان صورت گرفت. با بررسی پروتئین تام باکتري بر روي ژل SDS-PAGE میزان بیان در شرایط مختلف دما، غلظت IPTG و زمان القا سنجیده شد تا شرایط بهینه ي بیان بدست آید. مراحل bioassay این پروتئین در دست انجام می باشد.
کلمات کلیدي: بیان پروکاریوتی Antifungal peptide, Lipid transfer proteins,
مقدمه
پروتئینهاي ناقل لیپید - LTPs - ، پروتئین هایی با وزن مولکولی 7 تا 10 کیلودالتون هستند که در بعضی از بافت ها و اندام هاي گیاهی در غلظت هاي مختلف حضور دارند - . - 1 حضور غالب این پروتئین ها در ناحیه ي دیواره سلولی سلول هاي اپیدرمی و نیز افزایش در میزان بیان این ژن ها در پاسخ به حضور پاتوژن ها، نقش این LTP ها را در مکانیسم دفاعی گیاه تقویت می کند - . - 2 همچنین آنها می توانند بطور سینرژیک موجب تقویت توان ضد میکروبی سایر پپتیدهاي ضدمیکروبی نظیر دفنسین و تیونین شوند - . - 3 پروتئین هاي LTP به عنوان عضوي از پروتئین هاي مرتبط با پاتوژن ها - PR - در گروه PR-14 طبقه بندي شده اند - . - 4 بررسی هاي ژنومیک نشان میدهد که ژن هاي خانواده LTP II در گیاه برنج فاقد اینترون هستند - . - 5 بنابراین میتوان از میزبان پروکاریوتی براي بیان ژن ltp II استفاده نمود. در این تحقیق جهت بررسی فعالیت ضد قارچی پروتئین LTP برنج، ژن مورد نظر از ژنوم گیاه برنج جداسازي و در میزبان پروکاریوتی بیان گردید. پروتئین بیان شده در تستهاي bioassay علیه قارچ هاي بیماریزاي مختلف مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
مواد و روش ها
استخراج DNA ژنومی به روش CTAB انجام و از آغازگرهاي اختصاصی Oltp2B و Oltp2X براي تکثیر ژن ltp گیاه برنج استفاده گردید. توالی این پرایمرها عبارتند از :واکنش PCR بر روي DNA ژنومی و با استفاده از آنزیم pfu DNA polymerase در 35 سیکل به صورت 94 °C یک دقیقه، 62 °C یک دقیقه و 72 °C یک دقیقه انجام شد. قطعه تکثیر شده در پلاسمید pJET1.2 کلون گردید. کلیه مراحل کلونینگ مطابق روش هاي استاندارد انجام گردید . - Sambrook & Russel, 2001 - سپس قطعه تایید شده در وکتور بیانی pET-24d کلون و به باکتري E. coli Bl21 جهت بیان پروتئین ژن مورد نظر منتقل گردید. پروتئین هاي بیان شده در ژل 15 درصد SDS-PAGE الکتروفورز شد.
نتایج و بحث
دانه هاي برنج - Oriza sativa - ، به مدت دو هفته در شرایط مرطوب و تاریک در دماي 25 °C قرار داده شد تا جوانه بزنند سپس DNA ژنومی از برگ آنها استخراج گردید. با توجه به توالی ژنیltp II برنج با شماره دسترسی NC_008396 ، پرایمرها به گونه اي طراحی شد که کدون پایان از توالی پرایمر برگشتی حذف تا در هنگام بیان پروتئین در وکتور بیانی pET-24d ، توالی شامل شش اسید آمینه هیستیدین به پروتئین LTP بیان شده اضافه شود.واکنش PCR با آنزیم pfu بر روي ژنوم برنج انجام شده و قطعه تکثیر شده برروي ژل %1 آگارز الکترفورز و باند مورد انتظار به طول 300 bp مشاهده گردید - شکل . - 1قطعه مورد نظر از ژل آگارز بازیافت و ابتدا در ناقل کلونینگ pJET1.2 کلون گردید. سازه نوترکیب pJET1.2FZ با استفاده از الگوي هضم آنزیمی - شکل - 2 و همچنین تعیین توالی مورد تایید قرار گرفت.این سازه با آنزیم هاي Bpi I و Xho I هضم و قطعه ژن ltp خارج شدهبه درون وکتور بیانی pET-24d که با آنزیمهاي Nco I و Xho I برش داده شده بود، کلون شد. سازه نوترکیب pET-24FZ بدست آمده با االگوهاي PCR به کمک پرایمرهاي اختصاصی ژن و پرایمرهاي وکتور مورد تایید قرار گرفت - شکل. - 3
