بخشی از مقاله
چکیده:
سیب - Malus × domestica Borkh. - رایجترین میوههاي مناطق معتدله بوده و از زمانهاي باستان در اروپا و آسیا کشت شده است. زیاد بودن دوره نونهالی در سیب، باعت طولانی تر شدن دوره اصلاحی گردیده و اصلاح این نبات را بسیار مشکل می نماید. دستکاري ژنتیکی زمان گلدهی، طول دورة نونهالی و عادت گلدهی سیب مستلزم شناخت ژنهاي دخیل در فرآیند گلدهی و تکوین گل سیب و نیز بررسی نقش و عمل آنها میباشد.
بیشتر ژنهاي کنترل کننده گذر از فاز رویشی به فاز زایشی و نیز قسمت اعظم ژنهاي فعال در تنظیم هویت مریستم و تکوین اندامهاي گل در داخل گروهی از فاکتورهاي رونویسی بنام ژنهاي MADS-box قرار میگیرند. در این تحقیق، از بین ژنهاي MADS-box سیب، ژنهاي MdMADS1 و MdMADS3 - از سیب رقم گلدن دلیشز - 1 جداسازي و همسانه سازي گردیدند و توالیهاي آنها مورد بررسی قرار گرفت.
مقدمه:
سیب از نظر اهمیت بعد از مرکبات، موز و انگور مقام چهارم را در بین میوهها داراست. کشور ایران بعد از چین، آمریکا و لهستان با تولید 2/4 میلیون تن سیب در سال، مقام چهارم را در جهان به خود اختصاص داده است . - 3 - زیاد بودن دوره نونهالی در سیب، باعت طولانی تر شدن دوره اصلاحی گردیده و اصلاح این نبات را بسیار مشکل می نماید. دستکاري ژنتیکی زمان گلدهی، طول دورة نونهالی و عادت گلدهی سیب مستلزم شناخت ژنهاي دخیل در فرآیند گلدهی و تکوین گل سیب و نیز بررسی نقش و عمل آنها میباشد. بیشتر ژنهاي کنترل کننده گذر از فاز رویشی به فاز زایشی و نیز قسمت اعظم ژنهاي فعال در تنظیم هویت مریستم و تکوین اندامهاي گل در داخل گروهی از فاکتورهاي رونویسی بنام ژنهاي MADS-box قرار می گیرند.
با اینکه از بعضی از مطالعات چنین بر میآید که ناحیههاي MADS-box پروتئینهاي MADS-box درختان نقشی مشابه نقش آنها در گیاهان علفی دارند - 8 - ، ولی در مورد ویژگی هاي ناحیههاي پروتئینی MADS-box درختان اطلاعات خیلی کمی در اختیار است . - 9 - علت انتخاب ژنهاي MdMADS1 و MdMADS3 براي جداسازي این بود که این ژنها، مشابه ژنهاي SEP و متعلق به کلاس E بوده و در همه حلقه هاي گل تظاهر دارند 9 - و. - 11 بنابراین، پیش بینی میشود فوق تظاهر این گروه از ژنها احتمالاً باعث تسریع گلدهی و کوتاه کردن دوره نونهالی بدون بهم زدن مورفولوژي گل خواهد شد.
مواد و روشها:
بافت هاي گیاهی لازم براي استخراج آر.ان.اي از درختان پنج ساله سیب رقم گلدن دلیشز تهیه و با استفاده از ازت مایع مورد انجماد سریع قرار گرفتند. استخراج آر.ان.اي از جوانه و برگ با روش کلرید لیتیم انجام شد. آر. ان. اي حاصل در واکنش آر. تی. با استفاده از آنزیم SuperScript II - Invitrogen - بکار رفت. آغازگرهاي مستقیم و معکوس بکار رفته در واکنش هاي پی.سی.آر براي ژن MdMADS1، 5' - GGCGGATCCATGGGGAGAGGAAGAGTG - 3' و 5' - CGCATGGATCCTCAAAGCATCCATCCAG - 3' و براي ژن MdMADS3، 5’- GCAGGATCCCAGTTTGTCTACCTCTGA – 3’ و 5’ – CGCGGATCCGTATATACAAATTGGTCTC – 3’ بودند. توالی هاي جداسازي شده MdMADS1-Golden و MdMADS3-Golden نامیده شدند. براي همسانه سازي قطعات مورد نظر از کیت pGEM-T Easy - Promega - استفاده گردید و پلاسمیدهاي حاصل pNM101 و pNM102 نامیده شدند.
نتایج و بحث:
ژن MdMADS1 براي اولین بار در سال 1997 توسط سانگ و آن از رقم فوجی1 سیب جداسازي و همسانه سازي شده بود. این ژن به طول 992 جفت باز داراي یک ORF به طول 738 جفت باز، یک ناحیه 5’ به طول 29 جفت باز و یک ناحیه 3’ به طول 222 جفت باز میباشد. در این تحقیق ناحیه رمزآور این ژن به طول 741 جفت باز از رقم گلدن دلیشز سیب جداسازي و همسانه سازي شد. این ژن یک پلی پپتید 246 اسیدآمینهاي رمز می کند که از خانواده ژنهاي MADS-box می باشد.
ژن جداسازي شده از رقم گلدن دلیشز %99/9 با ژن گزارش شده MdMADS1 از نظر توالی نوکلئوتیدي مشابهت داشت، تنها با این تفاوت که به جاي نوکلئوتید 218 در MdMADS1 که G بود، در MdMADS1-Golden نوکلئوتید T قرار داشت و این باعث جانشینی ایلئوسین بجاي متیونین در زنجیره پلی پپتیدي MdMADS1-Golden گردید - امینواسید . - 63 این ژن با MdMADS8 یکی می باشد، با همان تفاوت MdMADS1 گلدن و فوجی. پس می توان گفت که ژن جدا شده شاید MdMADS8 باشد.
همچنین، این تفاوت ممکن است ناشی از اشتباه Taq DNA polymerase باشد. در این تحقیق، این ژن از آر.ان.اي حاصل از جوانه جداسازي گردید، در حالیکه نشان داده شده است که این ژن در بافت هاي دیگر مانند اندام هاي مختلف گل نیز تظاهر می یابد . - 9 - توالی اسیدآمینه اي این ژن %93 با MdMADS9، %79 با SEP1/AGL2 و %74 با SEP2/AGL4 شباهت دارد . - 9 - بنابراین، در گروه بندي ژنهاي MADS-box در گروه AGL2 قرار گرفت.
از نظر الگوي تظاهر نیز، این ژن شبیه ژن AGL2 در آرابیدوپسیس می باشد . - 9 - طی مراحل اولیه و میانی نمو گل، AGL2 به میزان زیادي در هر چهار حلقه گل تظاهر نشان می دهد. با پیشرفت مراحل تکوین گل، تظاهر AGL2 کاهش فوق العاده اي نشان داده است. تظاهر AGL2 در اوول ها، جنین ها و پوسته بذور نیز بالا بوده است . - 4 - اما، رونوشت AGL2 در برگ ها نیز قابل تشخیص بوده است - 5 - ، ولی رونوشت MdMADS1 در اندامهاي رویشی مشاهده نشده است . - 9 - فوق تظاهر این ژن نتیجه اي در تغییر زمان گلدهی در توتون نداشته است - 9 - ، اما شاید با تولید پادمعنی2 آن یا ایجاد هم-مهاري3 بتوان در تعیین نقش این ژن گام هایی را برداشت. جداسازي این ژن در این تحقیق، با همین هدف براي تحقیقات بعدي انجام شده است. متاسفانه، نقش ژنهاي گروه AGL2 زیاد معلوم نیست.
مطالعات گیاهان تراریخت ژنهاي معادل این ژنها در گیاهان دیگر مانند پتونیا و گوجه فرنگی، نقش میانجی گري بین ژنهاي هویت مریستم گل و هویت اندام گل را براي این ژنها پیشنهاد می کند 1 - و. - 7 ژن MdMADS3 براي اولین بار در سال 1999 از رقم فوجی سیب جداسازي و کلون گردیده است . - 10 - دي.ان.اي.مکمل این ژن با طول 1104 جفت باز داراي یک او.آر.اف4 رمز کننده یک پروتئین 248 اسیدآمینهاي، یک ناحیه 5’ به طول 81 جفت باز و یک ناحیه 3’ به طول 276 جفت باز میباشد. در این تحقیق معادل این ژن از رقم گلدن دلیشز جداسازي گردید.
این ژن در رقم گلدن از نظر توالی نوکلئوتیدي %98/9 با ژن رقم فوجی شباهت داشت، با این تفاوت که در رقم فوجی در ناحیه 5’ تعداد تکرار توالی GA به تعداد 6 تکرار کمتر از تعداد تکرار آن در رقم گلدن بیشتر بود. شاید بتوان از این اختلاف با ایجاد یک مارکر اس.اس.آر در شناسایی دو رقم از یکدیگر بهره جست. توالی اسیدآمینهاي استنتاجی این ژن %99 شبیه - 12 - MdMADS7 است، با این تفاوت که در موقعیت اسیدآمینه شماره 181، اسیدآمینه هیستیدین و در MdMADS3 اسیدآمینه گلیسین قرار دارد.
بررسیها در این تحقیق نشان داد که %83 MdMADS3 با MdMADS6 مشابهت دارد. ژن MdMADS3 نیز در گروه بندي فیلوژنتیکی ژنهاي MADS-box در گروه AGL2 قرار گرفت. پروتئین این ژن بیشترین شباهت را به - %63 - SEP1/AGL2 نشان داد و بعد از آن %61 به SEP2/AGL4 و %59 به SEP3/AGL9 شباهت داشت. از نظر الگوي تظاهر، ژن MdMADS3 اولین بار در مرحله 3 در سه حلقه درونی پریموردیوم گل تشخیص داده شد. با این حال طبق گزارش محققین، این ژن در آغازه- هاي جوانتر گل و یا در مریستم گل آذین هیچ تظاهري نشان نداد.
- 10 - الگوي تظاهر MdMADS3 شبیه الگوي تظاهر ژن FBP2 از پتونیا و TM5 از گوجه فرنگی و AGL9 از آرابیدوپسیس است که در گلبرگ ها، برچه ها و پرچم ها تظاهر دارند 1 - و6و. - 7 این ژنها بعد از شروع فعالیت ژنهاي هویت مریستم گل و قبل از فعال شدن ژنهاي هویت اندام گل تظاهر می یابند و این بدان معنی است که این ژنها احتمالاً در میانجی گري بین ژنهاي هویت مریستم گل و هویت اندام گل ایفاي نقش می نمایند. در درخت فیلوژنتیکی نیز ژن MdMADS3 در زیر گروه AGL9 قرار گرفت. کل دي.ان.اي.مکمل این ژن با استفاده از پرایمرهاي مذکور همسانه سازي شد. در شکل - 1 - تصاویر ژل الکتروفورز مربوط به آر.تی.-پی.سی.آر و کولونی-پی.سی.آر ژنهاي جداسازي شده آمده است.
