بخشی از مقاله
چکیده
پروتئینهاي ذخیرهاي غالب دانه ذرت، یعنی زئینها، از نظر محتواي اسیدآمینههاي ضروري مانند لیزین و تریپتوفان داراي کمبود هستند که این امر منجر به پائین بودن کیفیت غذائی دانه ذرت میشود. از طریق شناسایی موتانتها یا دستکاريهاي ژنتیکی انجام شده، نشان داده شده است دانههایی که میزان پروتئینهاي زئین آنها کاهش یافته، میزان کل اسیدآمینههاي لیزین و تریپتوفان در آنها افزایش پیدا کرده است. این گونه انگاشته میشود که این افزایش از یک سو ناشی از کاهش پروتئینهاي زئین فقیر از اسیدآمینههاي لیزین وتریپتوفان و از طرف دیگر افزایش پلیوتروپیک در پروتئینهاي غیر زئینی غنی از لیزین است. زیر خانواده 19kD از کلاس آلفا زئین %40 از کل پروتئینهاي زئین را تشکیل میدهد و تقریبا بصورت کامل از اسیدآمینههاي لیزین و تریپتوفان تهی است.
هدف از اجراي این تحقیق همسانهسازي قطعات ژنی مربوط به زیرخانواده 19kD به منظور تولید سازه پلاسمیدي RNAi - RNA interference - اختصاصی بذر براي خاموشی ژنهاي مربوط به این زیرخانواده از طریق فناوري RNAi میباشد تا از این طریق کاهش پروتئینهاي زئینی فقیر از اسیدآمینههاي ضروري و به دنبال آن افزایش پلیوتروپیک پروتئینهاي غیر زئینی غنی از اسیدآمینههاي لیزین و تریپتوفان فراهم گردد. در این تحقیق مبادرت به ساخت یک کاست RNAi جدید شده است که سبب بکارگیري RNA دورشتهاي - با جفت شدن توالیهاي همسو و ناهمسو - مربوط به زیرخانواده 19kD در گیاهان تراریخت میشود.
مقدمه
وجود سازه اختصاصی بذر براي تغییر ژنتیکی پروفایل پروتئینهاي ذخیرهاي دانه ذرت از مهمترین نیازهاست که در این تحقیق هدف گیري شده است. غلات منبع اصلی تامین پروتئین رژیم غذایی بشر محسوب میشوند. در سطح جهانی ذرت %15 پروتئین و %20 کالري رژیم غذایی را تأمین میکند. متاسفانه ارزش غذایی ذرت بخاطر فقیر بودن از نظر محتواي اسیدآمینههاي ضروري لیزین، تریپتوفان و متیونین ناشی از سهم نسبتا بالاي پرولامینها در پروتئین هاي ذخیرهاي ذرت که ذاتا از نظر این اسیدآمینههاي ضروري تهی هستند، پائین است - سوفی و همکاران، . - 2009 دلیل نگران کننده این است که لیزین و تریپتوفان، اسیدآمینههاي ضروري براي انسان و دامهاي غیر نشخوار کننده هستند.
بنابراین نیاز به توسعهي لاینهاي ذرت با لیزین بالا کاملا ضروري به نظر میرسد. موتانتهاي شناخته شده در ذرت با محتواي لیزین بالا - همانند اوپک2 و فلوري - 2 بخاطر داشتن صفات نامطلوب در گذشته معرفی نشدهاند - مرتز و همکاران، 1964؛ نلسون و همکاران، . - 1965 این گونه انگاشته میشود که افزایش در محتواي لیزین این دو موتانت از یک سو ناشی از کاهش پروتئینهاي زئین فقیر از نظر محتواي اسیدآمینههاي لیزین وتریپتوفان و از طرف دیگر افزایش پلیوتروپیک در پروتئینهاي غیر زئینی غنی از لیزین است.
پروتئینهاي پرولامینی دانه ذرت زئین نامیده میشوند و از یک کلاس بزرگ - آلفا زئین - و سه کلاس کوچکتر - بتا، گاما و سیگما زئین - تشکیل شدهاند. زئینها %60 پروتئینهاي آندوسپرم ذرت را تشکیل میدهند - کلمن و لارکینز، . - 1999 زیر خانوادهي 19kD از کلاس آلفا زئین %40 از زئینها را تشکیل میدهد و تقریبا تهی از اسیدآمینههاي لیزین وتریپتوفان است. هدف از اجراي این طرح همسانهسازي قطعات ژنی مربوط به زیرخانواده 19kD به منظور تولید سازه پلاسمیدي RNAi اختصاصی بذر براي خاموشی ژنهاي مربوط به این زیرخانواده از طریق فناوري RNAi میباشد.
مزیت این روش این است که طبیعت غالب ژن انتقالی متضمن پایداري کیفیت پروتئینی ذرت در مزارعی است که تحت درجات گوناگونی از آلودگی با دانههاي گردة ذرت نرمال هستند، در حالی که این موضوع یک مشکل جدي در موتانتهاي مغلوب اوپک2 است. RNA interference - RNAi - یک فرایند خاموشی پس از رونویسی ژن - Post- Gene-Silencing - Transcriptional و بر مبناي همولوژي است که با بکارگیري یک RNA دورشتهاي همولوگ ژن هدف، سبب تخریب mRNA آن میشود.
بکارگیري RNAi در گیاهان اغلب از طریق ترانسژنهاي تولید کننده RNA سنجاق سري - hairpin RNA - انجام میشود. مؤثر و قابل انعطاف بودن فناوري RNAi در خاموشی ژنهاي گیاهی منجر به استفاده گسترده از این فناوري شده است. فناوري RNAi نسبت به روشهاي Antisense-Mediated Gene Silencing و Cosuppresion در میزان خاموشی ژنهاي مورد نظر مؤثرتر و نیز در نسلهاي متوالی پایدارتر است.
مواد و روشها
جهت دسترسی به قطعات مورد نیاز DNAي ژنومی برگهاي رقم هیبرید 704 ذرت - در مرحله دو برگی - با استفاده از روش CTAB استخراج شد - شکل 1الف - . آغازگرهاي اختصاصی براي تکثیر قطعات مورد نظر با مراجعه به بانک اطلاعات نوکلئوتیدي NCBI و با استفاده از برنامه Primer3 و بر اساس توالی مربوط به زیرخانواده 19kD طراحی شد. این کاست از دو قطعه تشکیل شده است که قطعه اول بترتیب حاوي راهانداز و قسمتی از CDS - توالی کدکننده - یکی از ژنهاي زیرخانواده 19kD در جهت همسو - Pro & 19S - و قطعه دوم حاوي همان قسمت از CDS بصورت ناهمسو - 19AS - است که پس از رونویسی با CDS همسو جفت شده و سبب تشکیل RNA دورشتهاي میشود.
