بخشی از مقاله
چکیده
دستکاري مسیر سنتز کارتنوئیدها ممکن است باعث افزایش سطح کارتنوئیدها در گیاهان شود. با این حال، این دستکاري ممکن است مسیرهاي دیگر متابولیکی را که به نحوي با مسیر مورد نظر مرتبط می باشند، دستخوش تغییر کند. یکی از مسیرهاي متابولیکی که در پایین دست مسیر سنتز کارتنوئیدها قرار دارد، مسیر سنتز ABA است. این هورمون نقش اساسی در القاي دورمانسی فیزیولوژیک بازي می کند. بنابراین، احتمال می رود که هر گونه تغییرات در سنتز کارتنوئیدها، سنتز ABA را نیز تحت تاثیر قرار دهد. هدف از این تحقیق، بررسی اثرات احتمالی بیان فایتوئین سنتاز - PSY - در تولید هورمون ABA می باشد. براي این منظور، ژن PSY از گیاه نرگس، تحت کنترل دو نوع پروموتر متفاوت، به گیاه ذرت انتقال پیدا کرد.
نتایج اولیه نشان دادند که بیان این ژن باعث افزایش معنی دار - حدود - % 17 سطح عمومی کارتنوئیدها می شود. جالب اینکه، نتاج حاصل از گیاهان ترانسژنیک که PSY را تحت کنترل پروموتر اختصاصی دانه بیان می کنند، دورمانسی خود را بطور کامل از دست داده و بطور شگفت آوري در روي بلال تازه جوانه زدند. این مشاهده بسیار عجیب می باشد، زیرا پیش بینی می شد که با افزایش کارتنوئیدها، میزان تولید ABA نیز افزایش یابد، که این مطلب با مشاهدات انجام گرفته کاملا در تضاد است. تحقیقات تکمیلی در مورد اندازه گیري میزان ABA در بذور گیاهان ترانسژنیک و بررسی علل احتمالی این مشاهده در حال انجام می باشد.
مقدمه
کارتنوئیدها در سلامت انسانها نقش بسیار مهمی بازي میکنند . - 3 - ژن فایتوئین سنتاز - PSY - ، یک آنزیم کلیدي در مسیر سنتز کارتنوئیدها میباشد. مطالعات زیادي نشان داده اند که این ژن نقش بسیار مهمی در تنظیم سنتز کارتنوئیدها بازي میکند. بطوریکه، در چندین مورد، افزایش بیان این ژن با استفاده از مهندسی ژنتیک، باعث افزایش میزان کارتنوئیدها و بویژه بتا کاروتن شده است . - 4 ,2 - با اینحال، تا امروز، اثرات جانبی این نوع دستکاریها و تاثیر آنها در مسیرهاي متابولیکی مرتبط، چندان مورد توجه و بررسی قرار نگرفته اند. در این مطالعه، ما سعی کردیم که اثرات جانبی افزایش کارتنوئیدها را در گیاهان ترانسژنیک مورد ارزیابی قرار دهیم.
مواد و روشها
در این مطالعه، از بذور هیبرید F1 تلاقی Pa91 × H99 استفاده گردید. کشت بافت و انتقال ژن با استفاده از روش ابداع شده توسط احمدآبادي و همکاران - 1 - انجام گرفت. از سیستم گزینش قند مانوز براي انتخاب گیاهان تراریخته استفاده شد. در یکی از وکتورها، cDNAي ژن گیاه نرگس تحت کنترل پروموتر ویروس موزائیک گل کلم - 35S - قرار گرفت. در وکتور دیگر، این ژن تحت کنترل پروموتر ژن سنتز کننده ي زئین، که یک پروموتر اختصاصی آندوسپرم ذرت میباشد، قرار گرفت. پس از پرتاب پلاسمیدها به کالوسهاي جنین زا توسط دستگاه تفنگ ژنی، کالوسهاي تراریخت در روي محیط کشت حاوي مانوز گزینش شدند . - 1 -
رنگدانه ها با استفاده از استون، از بافت برگ گیاهان تراریخت و کنترل جدا شده و بوسیله ي دستگاه HPLC مدل Agilent 1100 جداسازي، شناسایی و اندازه گیري شدند. جداسازي رنگدانه ها با استفاده از روش تایر و یوکمن - 5 - 1 انجام شد. همه ي رنگدانه ها در برابر مقادیر شناخته شده از کارتنوتیدهاي استاندارد، اندازه گیري شدند. سپس، میزان کارتنوئیدها و کلروفیل بر اساس وزن خشک بافت محاسبه شدند. این آزمایش 3 بار تکرار شد و هر بار 3 نمونه اندازه گیري شدند.
نتایج و بحث
ابتدا گیاهان ذرت تراریخت با استفاده از هر دو وکتور که در یکی ژن PSY تحت کنترل پروموتر 35S و در دیگري تحت کنترل پروموتر اختصاصی بذر بود، تولید شدند. آنالیز مولکولی گیاهان تراریخته با استفاده از روشهاي PCR، ساترن و نورترن بلات انجام گردید. بر اساس نتایج حاصله از HPLC، میزان کارتنوئیدها در گیاهان تراریخت، حدود %17 افزایش نشان داد. نکته ي قابل توجه اینکه، این گیاهان هیچ گونه ناهنجاري مورفولوژیکی در طول دوره رویشی نشان ندادند و داراي رشد طبیعی بودند. تنها مورد جالبی که در دوره رشد زایشی گیاهان تراریخت مشاهده شد، این بود که در بلالهاي گیاهان تراریختی که ژن فایتوئین سنتاز را تحت کنترل پروموتر اختصاصی دانه بیان می کردند، بذور تازه از حالت دورمانت خارج شده و جوانه زده بودند - شکل . - 1
این مشاهده کاملا غیر منتظره و عجیب بود، زیرا افزایش کارتنوئیدها اصولا باید مسیر سنتز ABA را با فراهم نمودن پیش ماده ي بیشتر تقویت می کرد. از آنجا که جیبرلین ها نیز در شکستن دورمانسی مهم بوده و به نوعی از نظر پیش ماده با مسیر سنتز کارتنوئیدها در ارتباط می باشند، بنابراین می توان پیش بینی کرد که در مجموع بیان بیشینه PSY در بذر ذرت، تعادل بذر از نظر تولید هورمونهاي درگیر در القاي دورمانسی را در جهت شکستن آن به هم زده است. براي پاسخ به این سوالات و تایید فرضیه ها، تحقیقات تکمیلی من جمله تولید لاینهاي تراریخت بیشتر و اندازه گیري مقادیر هورمونهاي بذور گیاهان تراریخت و مقایسه آنها با گیاهان تیپ وحشی در حال انجام است.
