بخشی از مقاله
چکیده
گیاهان دارویی خانواده نعناعیان - Lamiaceae - به دلیل انعطاف اکولوژیکی بسیار زیاد نسبت به اقلیمهاي متنوع، ذخایر ژنتیکی مهمی محسوب میگردند. مرزنجوش - - Origanum vulgare گیاهی است پایا و خودگشن که از این خانواده است و انواع متعددي از متابولیتهاي ثانویه گیاهی از جمله ترپنوییدها و فلاونوییدها را بیشتر در کركها، برگ و ساقه و به ویژه گلهاي گیاه تولیدمیکند. به منظور بررسی تاثیر اسپري سالیسیلیک اسید - - SA بر میزان بیان ژن ترپن سنتاز - - terpene synthase TPS در گیاه دارویی مرزنجوش، این الیسیتور در3 غلظت مختلف 0 - ،100 و 200 میلی گرم بر لیتر - - - ppm در مدت زمان 72 ساعت در آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با سه تکرار در مرحله پیش گلدهی بر روي گیاه مرزنجوش کشت شده در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزي دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان - خوراسگان - اسپري شد. آنالیز نتایج نشان داد که میزان بیان ژن ترپن سنتاز تحت تاثیر سالیسیلیک اسید نسبت به شاهد افزابش معنیداري داشت که بیشترین میزان بیان و فعالیت آنزیم در غلظت 200 ppm در طول زمان 72 ساعت را در بافت ساقه نسبت به گیاه شاهد داشته است . - P<0.01 -
مقدمه
گیاهان گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به نام متابولیتهاي ثانویه را تولید میکنند که توسط انسان به عنوان ترکیب دارویی مصرف میشوند - اکسمن و همکاران،. - 2004 جنس Origanum L. متعلق به خانواده نعناعیان بوده که اکوتیپهاي آن داراي تنوع زیادي از نظر مورفولوژي است. در بین گونههاي این جنس گونههاي Origanum majorana L. و Origanum vulgare L. در ایران رشد می کنند که استفاده درمانی نیز دارند - طهماسبی و همکاران ،. - 1393 از این گیاه علاوه بر استفادههاي سنتی،در درمان بیماري هاي معده و روده، یبوست، ناراحتی هاي تنفسی - آسم - و به عنوان التیام دهنده و ضدعفونی کننده استفاده میشود - کوردالی و همکاران ، . - 2008 مرزنجوش گیاهی پایا،علفی به ارتفاع 25- 80 سانتیمتر، داراي ساقههایی راست و در بخش فوقانی منشعب، پوشیده از کرك و به رنگ سبز مایل به قرمز میباشدو برگهاي آن بیضوي به رنگ سبز تیره و پوشیده از کرك در سطح تحتانی پهنک و در کنارههاي آزاد آن است - طهماسبی و همکاران ، . - 1393متابولیتهاي ثانویه مرزنجوش بیشتر در کركها، برگ و ساقه و به ویژه گلهاي گیاه تولید میشود، سرشاخههاي گلدار این گیاه سرشار از ترکیبات فلاونوییدي و ترپنی میباشد.ترپن ها یکی از بزرگ ترین و گسترده ترین دسته متابولیتهاي ثانویه در گیاهان هستند و بیش از 20000 ترکیبات مختلف ترپن تا به امروز شناسایی شده است . ترپن ها توسط یک طیف گسترده اي از گیاهان و اجزاي اصلی رزین و اسانس - روغن هاي ضروري - تولید می شوند. بیش از 100 ترپن مختلف از گیاهان متفاوت جدا شده است - لوکاس و همکاران، . - 2010 سالیسیلیک اسید ترکیبی فنلی است که جزء فیتوهورمونها به شمار میآید و داراي اثراتی بر متابولیسم و بیوسنتز و همچنین فعالیتهاي اکسیداتیو و فعالیتهاي بیولوژیکی نظیر رشد و نمو،فتوسنتز، تنفس جذب و انتقال یونها، تغییر فعالیت برخی آنزیمهاي مهم و ساختار کلروپلاست میباشد - نادري و همکاران،. - 1395در این مطالعه اثر غلظتهاي مختلف هورمون سالیسیلیک اسید بر افزایش بیان ژن ترپن سنتاز - - TPS در اندام هوایی و ساقه گیاه مرزنجوش مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
پس از کشت بذرهاي مرزنجوش وحشی - مرکز تحقیقات جهاد کشاورزي اصفهان - نشاها به گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزي دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان - خوراسگان - در گلدان هاي حاوي پرلیت و کوکوپیت به نسبت مساوي منتقل شدند. جهت تیمار نمونهها از سالیسیلیک اسید با غلظتهاي 0 - ، 100 و - ppm 200 روي نمونهها در مرحله پیش گلدهی محلول پاشی شدند و در زمانهاي 0 - ، 24، 48 و 72 ساعت - بعد از محلول پاشی نمونهگیري و استخراج RNA با استفاده از کیت Traizol طبق پروتکل شرکت هم از گیاه تیمار شده و هم از گیاه شاهد که با آب مقطر محلول پاشی شده بود انجام شد. کمیت و کیفیت RNA استخراج شده با دستگاه نانودراپ تعیین شد به طوریکه میانگین غلظت RNA استخراج شده 750 نانوگرم بر میکرولیتر و نسبت طول موج 260 به 280 براي تمامی نمونهها بین 1/6 تا 1/9 بود. براي ساخت cDNA از کیت ترمو - Thermo tطل کطککلاصغyح Aشخط 2غهطصح صکططً 2™طAصطکهکل - شرکت فرمنتاز مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. طراحی آغازگرها به وسیله نرم افزارOligo با استفاده از توالیهاي موجود براي ژن ترپن سنتاز - TPS - و همچنین ژن بتا اکتین بهعنوان ژن کنترل داخلی، در بانک اطلاعاتی NCBI انجام شد - جدول. - 1 تکثیر هر دو ژن براي اندازهگیري بیان ژن توسط واکنشReal time PCR بر اساس روش استاندارد به صورت نسبی صورت گرفت.میزان نسبی بیان ژن با استفاده از 3 تکرار زیستی و 2 تکرار تکنیکی محاسبه شد.به منظور مقایسه بیان ژنها تجزیه واریانس بر اساس طرح بلوك کامل تصادفی انجام شد و مقایسه میانگینها با آزمون چند دامنه اي دانکن در سطح احتمال P≤0/01 ، به وسیله نرم افزار SAS صورت پذیرفت.
نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس به منظور بررسی ژن ترپن سنتاز - - TPS تحت تیمار سالیسیلیک اسید در ساقه گیاه مرزنجوش نشان داد که این ژن تحت تیمار سالیسیلیک اسید افزایش معنیداري داشته است - . - P<0.01 به طوري که میزان بیان ژن TPS تحت تیمار سالیسیلیک اسید در ساقه به ترتیب در 100ppm و ppm 200 در 72 ساعت حدود 1/8 و 3/6 برابر نسبت به گیاه شاهد به دست آمد. همچنین بررسی بیان این ژن در گیاه مرزنجوش بیانگر این بود که تاثیر افزایش غلظت تیمار از 100ppm به 200 ppm تاثیر بیشتري در بیان ژن روي ساقه این گیاه دارد. بیشترین میزان بیان ژن ترپن سنتاز در غلظت 200 ppm سالیسیلیک اسید ارزیابی شد . - P<0.01 - میزان بیان ژن ترپن سنتاز در تمامی نمونه هاي مورد بررسی در طول 72 ساعت روند رو به
افزایشی را دنبال نمود. نتایج کلی مطالعهاي که رسولی و همکارانش - 1393 - به منظور بررسی اثر منگنز و اسید سالیسیلیک بر بیان ژن منتون ردوکتاز - - MR و میزان منتول در گیاه نعناع فلفلی انجام داد ، بیانگر آن بود که ارتباط مستقیمی بین ژن MR و میزان منتول در گیاه نعناع فلفلی وجود داشت، به طوریکه با گذشت زمان با افزایش بیان ژن MR تحت تأثیر اسید سالیسیلیک میزان منتول نیز افزایش یافت درحالیکه تحت تأثیر منگنز هم بیان ژنMR و هم میزان منتول کاهش نشان داد.
در پژوهشی که در مورد بیان نیمه کمی ژنهاي مونوترپن سنتاز، ژرانیل دي فسفات سنتاز، بتاآمیرین سنتاز واسکوآلن اپوکسیداز در سطح رونوشت در برگهاي تیمارشده گیاه دارویی سیاه دانه با اسیدسالیسیلیک بود، نتایج نشان دهنده تغییر بیان متفاوت این ژنها در پاسخ به اسیدسالیسیلیک بود - الیاسی و همکاران، . - 1394 به طوري که بیان براي هر دو ژن پس از اعمال تیمار اسیدسالیسیلیک القا شده، افزایش یافت و در 24 ساعت پس از اعمال تیمار به حداکثر میزان خود رسید به طوري که در 72 ساعت پس از اعمال تیمار هنوز داراي سطح بالایی از بیان نسبت به گیاه شاهد بود. مطالعات اندکی در مورد اثر الیسیتورها بر میزان بیان ژن TPS صورت گرفته است . مقاله حاضر جزء نخستین گزارشهاي تأثیر سالیسیلیک اسید بر بیان ژن TPS بر اندام هوایی و ساقه گیاه مرزنجوش است . در این مطالعه تأثیر سالیسیلیک اسید بر بیان نسبی ژن TPS در غلظت 200 ppm در ساقه این گیاه نسبت به نمونه هاي شاهد با افزایش معنیداري گزارش شد. نتایج حاصل لز اعمال تیمار سالیسیلیک اسید نشان داد که ژن مورد مطالعه در این تحقیق در اثر تیمار سالیسیلیک اسید القا میشود. با توجه به این نتیجه میتوان تیمار سالیسیلیک اسید را براي افزایش بیان ژنها و آنزیمهاي درگیر در مسیر بیوسنتز ترپنها و القاي تغییر در مسیر بوسنتزي ترکیبات ترپنوییدي پیشنهاد کرد زیرا بر اساس مطالعات مختلف میزان تولید ترکیبات ترپنی با میزان رونوشت ژنهاي کلیدي در مسیر بیوسنتزي آنها ارتباط مستقیم دارد - مجدي و همکاران،. - 2015
