بخشی از مقاله
بعلت عدم شناخت کافی از نقش آنتی ژهنا, علیه بیماری تیفوئید,واکسن موثری در دسﱰس نیست. هدف ازاین ﲢقیق مطالعه نقش ایمن سازی پروتئینهای غیر پورینی در غشاء خارج سلولی ساﳌونلا می باشد. دو پروتئین به وزن مولکولی 33 و 49 کیلو دالتون جدا شده و مورد مطالعه قرار گرفت. این پروتئین ها کاملا غیر بیماری زا بوده و توانایی القاء اثر ﳏافظتی علیه باکﱰی و بیماری با درجات ﳐتلف حفاظتی را دارا می باشند ﲞصوص اینکه پروتئین با وزن مولکولی 49 KDa که اثر حفاظتی % 100در ایجاد مصونیت علیه بیماری را نشان میدهد. یافته شد این پروتئین 49 KDa هم بین ساﳌونلا تیفی و تیفیموریوم یکسان بوده بنابراین می توان از این پروتئین 49 KDa موجود در تیفیموریوم در ساخت واکسن مناسب علیه تیفوئید در انسان استفاده کرد.
مقدمه
ساﳌونلا از عوامل ایجاد بیماری تیفوئید در سطح جهان برای انسان و حیوانات است. در کشورهای در حال توسعه با وجود شیوع 16 میلیون بیمار و مرگ و میر 600 هزار نفر در سال، یک ﲞش عمده از بیماری های شایع در جهان را شامل می شود - . - 1 بعضی ازواکسن ها شامل اسﱰین2 های متعدد ضعیف شده بصورت واکسن های خوراکی، پروتئین های شوک گرمایی - HSP - 3 و یا آنتی ژهنای Vi خالص شده و یا بصورت اتصال با پروتئین های حامل جهت واکسن های وریدی موجود می باشد ولیکن بعلت عدم شناخت کافی از نقش آنتی ژهنا در ایجاد مصونیت علیه بیماری، واکسن موثری در دسﱰس نیست . - 2 - غشاء خارج سلولی شامل اجزاﺀ غیر پروتئین مانند لیپوپلی ساکارید - LPS - 4 و پروتئینهای آنتی ژن مانند HSP پروتئین های پورینی و غیر پورینی است - . - 3
پورین ها که از گروه های بسیار شناخته شده غشاء خارج سلولی می باشد, یک کاندید احتمالی برای توسعه واکسن علیه ساﳌونلاسیس در نظر گرفته شد - . - 4 ولیکن پورین هااختصاص به ساﳌونلا نداشته و پورین های باکﱰی های دیگر خانواده آنﱰوباکﱰیاسه6 واکنش های مشابه متقاطع 7 دارند.از سوی دیگر پورین ها دارای عوارضی چون ﲢریک ساخت سیتو کینهای بعد از التهاب8 و اکسید های نیﱰیک9 را دارند - . - 5 وجود پروتئین های دیگر غیر از پورین ها در غشاء ساﳌونلا, بعلت مشکلاتی که در جداسازی و خالص سازی دارند هنوز نقششان بطور کامل در بیماریزایی و یا در ایمنی سازی مورد مطالعه قرار نگرفته و هدف از این ﲢقیق بدین منظور است.
مواد و روش ها
اسﱰین φ36 باکﱰی ساﳌونلا تیفیموریوم در ﳏیط 10TSIA کشت, و با روش خالص سازی توسط اوره، جهت جداسازی پروتئین ها استفاده گردید و پس از زدودن ﳕک های ﳘراه به روش دیالیزینگ11و لیفولیزد12 گردیدو از روش13 تغییر یافته لوری - 6 - برای تعیین مقدار پروتئین استفاده شد. پروتئین های جدا شده, در معرض آنالیز SDS-PAGE 14 قرار گرفت. وزن مولکولی هر باند پروتئین با ﳏاسبه Rf مشخص گردید. از بین گروه پروتئین ها, دو پروتئین به وزن مولکولی 33 و 49 کیلو دالتون جدا شده و توسط روش , - 1992 - Talwarبصورت کمپلکس پروتئین-پلی آکریلمید 15 در آورده - - 7و جهت مطالعه نقش آن در ایمن سازی علیه تیفوئید، به موش های Swiss-Albino در چهار نوبت - روزهای - 28-21-7-1 تزریق ﳕوده و در روز 35 یک دوز تشدید کننده از امولسیون این کمپلکس در ,16IFA تزریق گردید.
لازم به ذکر است که به گروه موش های کنﱰل فقط سرم ﳕکی داده شده است. در روز 50،کل موش ها از طریق روده ای, آلوده به50X و100X دوز کشنده - 17 - LD باکﱰی شدند.LD50 باکﱰی ها با روش - 1938 - Reid ﳏاسبه گردید - . - 8 موش ها به مدت دو هفتهزیر نظر گرفته شدند و نتیجه بصورت درصد زنده ماندن در جدول 1 و نرخ زنده ماندن در ﳕودار 1 بیان شده اند. سپس به منظور مطالعه میزان زدوده شدن باکﱰی بعد ازایمیونیزاسیون18 موش ها با پروتئین های انتخابی, طحال و کبد موش ها، خارج شده و پس ازﳘوژنیز,19 در NA20کشت داده شد و سپس به ﳏیط کشت TSI انتقال و تعداد کلونی های رشد یافته باکﱰی ﴰارش و نتیجه با فرمول [Log10 CFU / gm Tissue] ﳏاسبه گردید.
تکنیک ایمیونودیفیوژن21 برای تعیین واکنش آنتی بادی های موجود در سرم بیمار مبتلا به تیفوئید با پروتئین های جدا شده از ساﳌونلا تیفیموریوم بکار گرفته شد.ﲟنظور روشن ساخﱳ پاسخ های ایمنی اختصاصی بدن انسان, از روش ایمیونووسﱰن بلاتینگ22 با انتقال باندهای پروتئینی به نیﱰوسلولز و بکارگیری آنتی بادی ثانویه IgG خالص شده انسان استفاده گردید. در هنایت, جداسازی و خالص سازی پروتئینهای استخراج شده, توسط ستونکروماتوگرافی سفاکریل23 S-300Hاﳒام شد واز SDS-PAGEدر جهت تایید پروتئینهای خالص شده,استفاده شد.
نتایج و ﲝث
به علت کاربردآسان و ﳘچنین به علت آنکه اوره به جداسازی به روش 24UE،راحتی قابل جدا شدن است, مورد استفاده قرار گرفت, چرا که اوره تداخلی با روش های تعیین مقدار و نوع پروتئینها ندارد. توسط روش ,SDS-PAGE ﳎموعه ای از باندهای پروتئینی با وزن مولکولی کمﱰ از 60 کیلو دالتون و تعداد کمی نیز باوزن مولکولی بیش از 60 کیلو دالتون قابل مشاهده بودند, که این یافته با یافته گزارش شده - Blanco - 1993 نیز تایید می شود - . - 9 اثر دو گروه از پروتئینها با وزن مولکولی 33 و 49 کیلو دالتون در ایمن سازی علیه تیفوئید مورد مطالعه قرار گرفته و نتایج حاصله این بود که این پروتئین ها کاملا غیر بیماری زا بوده و توانایی القاء اثر ﳏافظتی و ایمنی علیه باکﱰی و بیماری را با درجات ﳐتلف حفاظتی را دارا می باشند ﲞصوص اینکه پروتئین با وزن مولکولی 49 KDa که اثر حفاظتی % 100 در ایجاد مصونیت علیه بیماری را نشان می دهد - ﳕودار . - 1
بعلاوه در ﳘه موش های ایمیونیز شده، زدوده شدن باکﱰی از سیستم رتیکلواندوتلیال25 مشاهده گردید. ﳘچنین پروتئین 49 KDa، نقش بسزا و موثری در جلوگیری از جایگزینی باکﱰی در کبد و طحال حیوان بازی می کند - ﳕودار. - 2این یافته نیز با یافته های گزارش شده - Braquet - 1995 مطابقت میکند - . - 10 واکنش آنتی بادی های موجود در سرم بیمار تیفوئید با پروتئین های غیرپورینی غشاء خارج سلولی با وزن مولکولی 49 KDa در ایمیونودیفیوژن مشاهده گردید. در ایمیونووسﱰن بلاتینگ, این نکته روشن گردید که این پروتئین 49 KDa هم بین ساﳌونلا تیفی26 و ساﳌونلا تیفیموریوم که به ترتیب سبب تیفوئید در انسان و موش میگردند, یکسان بوده و دارای نقش ﲢریک سیستم ایمنی بدن را دارا می باشند. بنابراین می توان از این پروتئین 49 KDa موجود در تیفیموریوم در ساخت واکسن مناسب علیه تیفوئید در انسان استفاده کرد.
