بخشی از مقاله
خلاصه
در این تحقیق ترکیبات فرار شکوفه بهارنارنج توسط دو روش استخراج تقطیر با آب - HD - و میکرواستخراج فاز جامد از فضای فوقانی به کمک امواج فراصوت - UA-HS-SPME - جفت شده با GC/MS، جداسازی و شناسایی شدند. در روش SPME، ترکیبات فرار نمونهها به کمک امواج فراصوت تحریک و سپس از فضای فوقانی نمونه بر روی فیبر تجاری پلی دی متیل سیلوکسان - PDMS - به خوبی فیبرهای نانوپوروس دست ساز جمعآوری شدند. به منظور کسب نتایج بهتر، شرایط استخراج برای فیبر PDMS بهینه گردید.
تحت شرایط بهینه - یعنی زمان امواج فراصوت 15 دقیقه، زمان استخراج 30 دقیقه و دمای استخراج 55 درجه سانتیگراد - تعداد 52 ترکیب توسط روش UA-HS-SPME-GC/MS شناسایی شد. ترکیبات اصلی شناسایی شده در هر دو روش به ترتیب عبارتند از: linalool، linalyl acetate، limonene، - myrcene، geranyl acetate و .neryl acetate اما یک اختلاف قابل ملاحظه در درصد ترکیبات شناسایی شده نمونه های مختلف و روشهای مختلف مشاهده شد.
.1 مقدمه
امروزه منابع گیاهی به عنوان جانشین مواد شیمیایی در داروها و مواد غذایی مورد توجه روزافزون قرار گرفته و یافتن اثر ضد میکروبی گیاهانی که قرن ها به طور سنتی مصرف خوراکی و دارویی شده اند، از اولویت بیشتری برخوردار است .[1] بهارنارنج با نام علمی Citrus aurantium L همان شکوفه درخت نارنج است که در فصل بهار درخت را زینت داده، در پاییز و زمستان، جای خود را به میوه نارنج میدهد. این گیاه به راستهی Geraniales و خانواده Rutaceae تعلق دارد .[2] اسامی عمومی دیگری نظیر گل نارنج، لارنج، شفش و کباد نیز برای آن به کار می رود.
این گل اگرچه در پخت مربا مورد استفاده قرار میگیرد ولی کاربرد اصلی آن به همان صورت گل خشک و به خصوص عرق در طب گیاهی است. چندین ترکیب فعال زیستی مانند آلکالوئیدها، لیمونوئیدها، فیتو استرولها، فلاونوئیدها، فیبرهای غذایی و روغن های ضروری با اثرات درمانی از نارنج استخراج شده است .[3-10] از میان آنها، اسانس نارنج که نرولی - Neroli - نامیده می شود، ارزش غذایی، دارویی و اقتصادی زیادی دارد.
برای مصرف دارویی، شکوفههای بهارنارنج را صبح زود به حالت غنچه نشکفته میچینند و سپس در محلی تاریک سریع خشک میکنند تا تغییر رنگ ندهنداسانس. نارنج معمولاً به خاطر فعالیت های بیولوژیکی گسترده مانند فعالیتهای ضد میکروبی، ضد قارچی، آنتی اکسیدانی و ضد اضطراب، به عنوان یک اسانس ایمن شناخته می شود .[11-14] مهمترین خاصیت دارویی بهارنارنج تاثیر آن روی سیستم عصبی بدن است.
بهارنارنج آرامش بخش و ضد هیجانات دستگاه عصبی است و سردرد های عصبی و همچنین میگرنی را کاهش میدهد. بهارنارنج در تقویت معده بسیار مؤثر است و تپش نامنظم قلب، تشویش و اضطراب را از بین میبرد. برای کنترل تشنجها و حمله قلبی هم بهارنارنج را توصیه میکنند. اسانس نارنج شدیداً به اکسیداسیون حساس است چون اکسیداسیون به تغییر شدید در عطر و بوی آن منجر می شود.
روغن نرولی از گل های کوچک، سفید و روغنی درخت نارنج، با روش تقطیر با بخار استخراج می شود و غلظتی حدود 0/8 تا 1 درصد دارد. GC-MS و GC-olfactometry - بویایی سنجی - به طور گسترده برای مطالعه ترکیبات معطر نارنج مورد استفاده قرار گرفته اند .[15-20] ترکیبات شیمیایی اصلی روغن نرولی عبارتند از linalool، linalyl acetate و .[21] limonene روش های معمول استخراج اسانس عبارتند از: فشاردادن تحت سرما - cold-pressing - ، تقطیر با آب، تقطیر با بخار و روش های استخراج با حلال. این روش ها به خاطر سادگی اجرا و هزینه پایین، هنوز هم رایج هستند اما محدودیت های خاصی دارند.
روش های نمونه برداری از فضای فوقانی نظیر HS-SPME در زمینه استخراج ترکیبات فرار از گیاهان دارویی ومواد غذایی بسیار گسترش یافته و مورد توجه قرار گرفته اند. تکنیک HS-SPME یک روش جایگزین برای تکنیک های معمول استخراج، در مقیاس تجزیه ای می باشد. این تکنیک استخراجی، امکان به دست آوردن پروفیل های طبیعی تری از مواد معطر نمونه های گیاهی را فراهم می سازد. تاکنون هیچ تحقیقی درباره ی میکرو استخراج فاز جامد از فضای فوقانی به کمک امواج فراصوت، برای بهارنارنج صورت نگرفته است. بنابراین موضوع این تحقیق، بررسی توانایی روش UA-HS-SPME در استخراج ترکیبات فرار بهارنارنج و مقایسه آن با روش تقطیر با آب - HD - و اندازه گیری با GC/MS می باشد.
.2 بخش تجربی
.1-2 مواد
متانول، نیتروبنزن، استون، دی اتیل اتر، اتانول، نرمال هگزان و سایر حلال های آلی از شرکت مرک تهیه و بدون خالصسازی اضافی مورد استفاده قرار گرفتند. مخلوط نرمال آلکان ها از C8-C20 با غلظت40 میلیگرم بر لیتر در نرمال هگزان از شرکت Fulka تهیه شد. آب دو بار تقطیر با استفاده از دستگاه آب دوبار Fi-Streem مدل - UK - Fisons تهیه شد.
.2-2 وسایل و دستگاه ها
به منظور جداسازی، اندازهگیری و شناسایی ترکیبات از دستگاه کروماتوگراف گازی مدل Shimudzu-17A مجهز به طیف سنج جرمی مدل MS-QP5050 استفاده شد. جداسازی ترکیبات در ستون موئین fused silica از نوع BP-X5 - 95% polydimethyl siloxan, 5% phenyl - با قطر داخلی 250 میکرومترو طول 30 متر و ضخامت فیلم نازک 25 میکرومترو گاز حامل هلیم با خلوص %99/999 به عنوان گاز حامل استفاده شد.
به منظور استخراج ترکیبات به روش HS-SPME از فیبر تجاری PDMS با ضخامت 100 میکرومتر ساخت شرکت Supelco امریکا استفاده شد. همچنین برای نگهداری فیبرها از نگهدارنده دستی فیبر SPME ساخت شرکت Supelco استفاده شد. به منظور ایجاد تنش و آزاد سازی ترکیبات از بافت نمونه به فضای فوقانی از حمام فراصوت - التراسونیک - 5/5 لیتری با قدرت 18 مگاهرتز، مدل 5RS استفاده شد.
دستگاه سانتریفوژ Eppendorf 5810 که قابلیت چرخش تا 11000 دور بر دقیقه را دارد، برای سانتریفوژکردن استفاده شد. برای توزین دقیق نمونه ها از ترازوی دیجیتال Shimudzu مدلAX 120 ساخت ژاپن استفاده شد. برای تهیه آب دو بار تقطیر از دستگاه آب دوبار Fi-Streem مدل - UK - Fisons استفاده شد. شناسایی ترکیبات با استفاده از پارامترهای زمان بازداری - tR - ، شاخص بازداری - RI - ، مطالعه طیف های جرمی و مقایسه آنها با اطلاعات موجود در کتابخانه دستگاه GC/MS توسط برنامه کامپیوتری و کتابخانه Wiley 29 صورت گرفت.
.3 جمعآوری و آماده سازی نمونه
دو نمونه تازه بهارنارنج شیراز و بابل در فروردین 88 جمع آوری شده و به صورت مجزا در سایه خشک شدند. یک نمونه قدیمی تر بهارنارنج شیراز نیز در همین ایام خریداری شد. نمونه ها سپس آسیاب شده و در ظرف های در بسته در محیط آزمایشگاه برای آنالیز قرار داده شدند.
.1-3 استخراج به روش تقطیر با آب - Hydrodistillation -
برای استخراج به روش HD، مقدار 40 گرم از نمونه وزن و به بالن تقطیر 500 میلی لیتری انتقال داده شد. سپس 250 میلی لیتر آب مقطر به بالن اضافه گردید. بالن روی هیتر قرار گرفت و به دستگاه کلونجر متصل شد. سپس هیتر روشن شده و به مدت 1 ساعت زمان داده شد تا استخراج انجام گیرد. پس از این مدت روغن اسانسی به رنگ کرم روشن و به صورت لایهای مجزا روی آب تشکیل شدکه با سرنگ کاملاً تمیز از دستگاه کلونجر خارج گردید. سپس توسط سولفات سدیم عمل آب گیری انجام شد و در نهایت روغن اسانسی حاصله که حجم آن حدود 500 ʽL بود، به شیشه کاملاً مات منتقل و تا زمان تزریق به دستگاه GC/MS در یخچال و در دمای 4 °C نگهداری گردید.
.2-3 مراحل استخراج ترکیبات فرار بهارنارنج به روش UA-HS-SPME
الف - 1 گرم از گیاه آسیاب شده به داخل ظرف استخراج منتقل و دهانه ظرف با درب لاستیکی - سپتومی - بسته شد.
ب - ظرف استخراج در داخل حمام آبی قرار گرفته و به مدت 15 دقیقه در دمای 55 °C در معرض امواج فراصوت قرار گرفت - امواج فراصوت سبب تسریع در آزاد سازی ترکیبات از بافت نمونه شده و به این ترتیب زمان رسیدن به حالت تعادل در فضای فوقانی را کاهش میدهند - .
ج - فیبر تجاری PDMS به مدت 30 دقیقه در فضای فوقانی نمونه - به منظور جذب ترکیبات فرار - قرار داده شد. برای این کار سرنگ فیبر از سپتوم به درون ظرف وارد شده و فیبر به آرامی به بیرون از سرنگ محافظ هدایت شد و در فضای فوقانی ظرف قرار گرفت.
د - بعد از اتمام زمان استخراج، فیبر به آرامی درون نگهدارنده سوزن کشیده شد.
ه - در انتها به منظور واجذب ترکیبات، فیبر بلافاصله و به مدت 2 دقیقه در محل تزریق دستگاه GC قرار گرفت. در شرایطی که نمونه خشک و با آسیاب پودر شده بود دو حالت مجزا بررسی شد، در یک حالت آنالیز بدون افزودن آب انجام شد و در حالتی دیگر به همان مقدار نمونه 1 - گرم - 200ʽL آب دو بار تقطیر افزوده شد.
.4 شناسایی با MS
شناسایی کیفی ترکیبات با استفاده از پارامترهایی مثل شاخص بازداری - RI - ، مطالعه طیفهای جرمی و مقایسه این طیفها با طیفهای استاندارد موجود در کتابخانه دستگاه GC صورت می گیرد. در این تحقیق نیز تمام ترکیبات از طریق مقایسه طیف جرمی آنها با طیفهای استاندارد موجود در کتابخانه Wiley 29 به همراه تطبیق شاخص بازداری آنها با مقادیر گزارش شده برای ترکیبات استاندارد در متون علمی شناسایی شدند. RI
