بخشی از مقاله
مروری بر مارکر مولکولیSNP در مقایسه با میکروستلایت و کاربرد آن در ژنتیک
چکیده در دهــههــای گذشــته از مارکرهــای میکروســتلایت بطــور موفقیــت آمیــزی بــرای شناســایی حیوانــات و تســت
صفات پدری آنها استفاده میشـد. اخیـرا" بـا پیشـرفت نـرم افـزاری کامپیوترهـا، شناسـایی مـارکرSNP از قطعـات ژنــوم DNA آســان شــده اســت. SNP هــا واحــدهای اساســی تنــوع ژنتیکــی هســتند و نســبت بــه بقیــه مارکرهــا
جذابیت خاصـی دارنـد، ایـن مـارکر در گاوهـا فـراوان بـوده و از نظـر ژنتیکـی در پسـتانداران پایـدار مـی باشـند. مقایسه مارکرهـای میکروسـتلایت بـا SNP نشـان مـی دهـد کـه در مـورد میکروسـتلایت هـا، معمـولا دادههـای
تولید شده در آزمایشگاههای مختلف را به دلیل ناسازگاری در انـدازه آلـل هـا نمـی تـوان بـا هـم مقایسـه کـرد، در بعضی حالات بـه دلیـل حـذف و یـا اضـافه هـا در تـوالی فلانکینـگ، در محصـول PCR ممکـن اسـت دو آلـل متفاوت باشند، در حالیکـه انـدازه یکسـان دارنـد. مسـئله نامگـذاری در SNP هـا خیلـی سـاده تـر مـی باشـد،
چون نتایج می توانند به صورت بله و یا خیر کد شوند و وجود یا عـدم هـر کـدام از دو آلـل مـی توانـد بـه آسـانی بررسی شود، اما در مورد میکروستلایت ها زمان زیـادی بایـد بـرای خوانـدن داده هـا، حتـی بـا اسـتفاده از نـرم افزارهای بسیار کارآمد صـرف کـرد. انـواع اشـتباهات و فراوانـی آنهـا در میکروسـتلایت هـا و SNP هـا متفـاوت است. در مورد میکروستلایت ها اشتباه معمـول، تعیـین انـدازه اسـت، امـا در مـورد SNP هـا اشـتباه مربـوط بـه عدم تشخیص یکی از دو آلـل مـی باشـد. ارزش هتروزیگوسـیته پـایینترSNPهـا در مقایسـه بـا میکروسـتلایت-ها، اسـتفاده از تعـداد SNP هـای زیـادتری را ایجـاب مـی کنـد و عـدم اسـتقلال را باعـث مـیشـود. در چنـین
حالاتی اگر آنالیز با فرض وجود استقلال آمـاری بـین مـارکر انجـام شـود، تـوان پـایین خواهـد آمـد و برآوردهـا اریب خواهند بود. در ژنتیک جمعیت، خنثـی بـودن مـارکر از فرضـیات اصـلی مـی باشـد. میکروسـتلایت هـا بـه ندرت در ناحیه کد کننده پیدا می شوند و خنثی مـی باشـند. امـا در مـورد SNP هـا بایـد بـرای هـر مـارکر فـرض
فــوق کنتــرل شــود. لازم بــه ذکــر اســت کــه تمــام میکروســتلایت هــا خنثــی نبـوده، بلکــه از هــر 10 مــارکر میکروســتلایت دو مــارکر غیــر خنثــی وجــود دارد. نــرخ موتاســیون در میکروسـتلایت هــا 10-5 در مقایســه بــا SNPها 10-9 بسیار زیاد می باشد.
واژههای کلیدی: ژنوم، ژنوتایپینگ ،موتاسیون، میکروستلایت، SNP
1
مقدمه
در طی 10 سال گذشته، مارکرهای مولکولی که نشاندهنده پلی مورفیسم قابل مشاهده در سطح DNA میباشند، بخش وسیعی از پژوهشهای ژنتیک حیوانی را به خود اختصاص داده اند و امروزه نقش کلیدی در ژنتیک مولکولی دارند. به دلیل وجود تکنیکهای مولکولی متفاوت برای تولید آنها و ویژگیهای متفاوت هر کدام، انواع زیادی مارکر موجود است که میتوان با توجه به اهداف هر پژوهش و با در نظر گرفتن شرایط جانبی از جمله هزینه، گونه مورد پژوهش و سایر شرایط، مناسبترین مارکر را انتخاب کرد .(Vignal et al, 2002: 275) در بین سالهای 1980 تا 1990 مارکر RFLP1 بهترین مارکر برای پژوهشهای مولکولی بود، سپس با کشف مارکر میکروستلایت و درک ویژگیها و توانایی آنها مثل کاربرد آسان و پلی مورفیسم بالا، استراتژی فوق تغییر یافت و نقشه یابیهای ژنتیکی موفق در گیاه بر اساس مارکر میکروستلایت صورت می گرفت. تغییر استراتژی فوق به دو دلیل بود: یکی زیاد بودن تعداد آلل به ازاء هر لوکوس در میکروستلایت ها یا به عبارت دیگر پلی مورفیسم بالای میکروستلایت ها که با مقدار هتروزیگوسیته بالا، امکان کاهش تعداد خانوادههای مورد استفاده برای ایجاد نقشه ژنتیکی را فراهم می کرد و مورد دیگر امکان استفاده از روش PCR2 و سپس بررسی محصولات PCR و تعیین اندازه قطعات در ژل پلی اکریل آمید. بعد از اینکه میکروستلایتها تقریباً یک دهه به عنوان مارکر اصلی و غالب در پژوهش های ژنتیکی انسان و حیوان استفاده شدند، مارکر دیگری به نام SNP در تحقیقات ژنتیکی حیوان و به ویژه انسان وارد شد و نقش عمدهای در تحقیقات ژنتیک جمعیت، پزشکی قانونی و آنالیز ژنتیکی بیماریهای ایفا کرد
.(Vignal et al, 2002: 277)
نشانگرها (مارکرها)
بطور کلی نشانگرها به دو گروه مورفولوژیکی و مولکولی تقسیم مـی شـوند، نشـانگرهای مولکـولی شـامل دو دسـته نشـانگرهای پروتئینی و نشانگرهای DNA می باشند. نشانگرهای پروتئینی شامل ایزوزایم ها و پروتئینهای ذخیره ای هستند. نشانگرهای DNA از طریق تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل مشاهده هستند. اصول و کاربرد نشانگرهای DNA تفاوت قابـل ملاحظـه ای بـا سـایر نشانگرهای ژنتیکی، مانند نشانگرهای مورفولوژیکی و پروتئینی ندارند. بطور کلی ابداع و معرفی واکنش زنجیره ای پلیمراز بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. واکنش زنجیره ای پلیمراز یک روش تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعـات مورد نظر DNA است، که به دلیل اهمیت و نقـش مـؤثر PCR در تحـول و تکامـل روز افـزون فـن آوری نشـانگرهای DNA، ایـن نشانگرها را می توان به دو دسته کلی نشانگرهای مبتنی بر PCR و نشانگرهای غیر مبتنی بـر PCR تقسـیم نمـود ( Gupta et al, .(1999: 369
در هنگام استفاده از مارکرهای مولکولی در تحقیقات ژنتیکی، باید چند نکته کلیدی را مورد توجه قرار داد. از نقطه نظر آماری، تعداد زیادی از ویژگیهای مارکرها از قبیل روابط غالبیت، میزان اطلاعات تولیدی توسط هر مارکر، خنثی بودن مارکر، استقلال ژنتیکی مارکر و موقعیت مارکر روی نقشه، باید مورد توجه قرار گیرد و برای تولید داده های ژنوتایپینگ در مقیاس وسیع، روش ژنوتایپینگ باید تا حد ممکن ساده و ارزان باشد. انواع پراکنش در سطح DNA را میتوان از نظر مکانیسم مولکولی به سه دسته زیر تقسیم کرد: تغییر در یک نوکلئوتید (SNP1)، حذف2 یا اضافه شدن3 یک تا چند صد جفت باز((Indel و تعداد متفاوت ردیفهای تکراری(.(VNTR6 اگر مارکرها بر اساس اطلاعاتی که در یک لوکوس ایجاد میکنند بررسی شوند، میتوان آنها را به سه دسته تقسیم کرد که عبارتند از: غالبیت دو آللی از قبیل، رپید(RAPD)4 و ای اف ال پی(AFLP )5، همبارزی دو آللی از قبیل، آر اف ال پی((RFLP ، (SNP)، اس اس سی پی(SSCP)6 و همبارزی چند آللی از قبیل، میکروستلایتها که مارکرهای با خصوصیت غالبیت دو آللی کمترین، و مارکرهای با خصوصیت همبارزی چند آللی بیشترین اطلاعات را به ما میدهد و حالت دوم (همبارزی دو آللی) بینابین میباشد. با توجه به ویژگیهای مارکرها، میتوان به چگونگی تکامل مارکرها پی برد یا بعبارت دیگر با پیشرفت در زمینه
تکنیک های مولکولی در هر دوره، یکی از مارکرها بیشتر از بقیه رواج داشته است
.1998: 717; Vignal et al, 2002: 275)
خصوصیات یک نشانگر مناسب
یک نشانگر مناسب باید دارای یکسری ویژگیها باشد، از جمله: برای مطالعات تنوع ژنتیکی، مارکر باید چند شکلی باشد، توارث همبارز داشته باشد و بتوان هموزیگوت و هتروزیگوت را تشخیص داد، باید بطور یکنواخت و فراوان سراسر ژنوم را تحت پوشش قرار دهد، تکرار پذیر باشد، استفاده از آن آسان و سریع بوده و ارزان باشد و تبادل داده های آن به آزمایشگاههای دیگر امکانپذیر باشد
Vignal et al, 2002: 275)و نقوی، .(1384
میکرو ستلایتها یا ریز ماهواره ها
قطعات کوتاهی از DNA که متشکل از واحدهای تکراری 2-6 جفت نوکلئوتیدی مثل AT ، CCT و ATGT بـوده و طـول آنهـا بین 60-100 جفت باز یا بیشتر است. ریز ماهواره ها تحت عنوان توالی کوتاه تکراری (STR)7 یا توالی سـاده تکـراری(SSR)8 نیـز شناخته شده اند. این نشانگرها با دارا بودن خصوصیاتی مثل داشتن سطح بالایی از اطلاعات، تصادفی بـودن، فراوانـی بـالا در ژنـوم ساده بودن تفسیر نتایج و کاربرد آنها، تنوع آنها، چند اللی و همبارز بودن آنها و همچنین تکثیر بالا در PCR بعنـوان یـک سیسـتم نشانگری عمده DNA در ژنتیک گیاهی و دامی مطرح می باشند. ژنوم موجودات عالی، انباشته از نسخه های متعدد توالیهای سـاده DNA می باشد که با اندازه های متفاوت در تمام طول ژنوم پراکنده شده اند. قاعده کلی بر این اسـت کـه توالیهـای بـا واحـدهای بزرگتر، جایگاههای طویلتری را بر روی ژنوم به خود اختصاص می دهند. در صدر این توالیهای DNA ، ماهواره ها یا ستلایتها1 قرار دارند که حاوی قطعات 100 جفت باز یا بیشتر می باشند، که طول آنها به چندین مگا جفت باز نیز می رسد. ردیفهای ریز مـاهواره ای غیر پایدارند و با کاهش یا افزایش واحدهای تکرار شونده دچار تغییرات فراوان در طول می شوند. ریز ماهواره ها نخستین بار در ژنتیک انسانی برای تشخیص برخی از بیماریهایی که با تغییر تعداد واحدهای تکرار شونده ریز مـاهواره هـا همـراه بودنـد، اسـتفاده شدند. تنوع در تکرار ریز ماهواره ها که به کمک PCR و الکتروفورز قابل آشکار سازی اند، موجب شده است که از ریزماهواره ها بـه عنوان ابزار مولکولی با پتانسیل بسیار زیاد، برای تشخیص های ژنومی در آزمایشگاهها استفاده شود. امروزه نشانگرهای ریز مـاهواره-ای به وفور در مطالعات مختلف مورد استفاده قرار می گیرند. از مهمترین کاربردهای میکروستلایت ها می تـوان بـه مطالعـه تنـوع ژنتیکی، مطالعه فیلوژنی و تکامل، تهیه نقشه ژنومی، همسانه کردن ژنـی و نقشـه یـابی ژنتیکـی، پژوهشـهای اکولـوژیکی و تکامـل جمعیتها، انتخاب نشانگر همراه با صفت مورد نظر، خالص سازی مواد ژنتیکی و انجام تحقیقات سیتولوژیکی برای شناسایی لاینهای با کروموزوم اضافی2 و لاینهای با جایگزینی کروموزومی3 اشاره کرد ( .( Khlestkina et al, 2006:725; Lopez et al, 2005:637
ریز ماهواره ها دارای یکسری معایب نیز هستند که عبارتند از: -1 شناسایی ریز مـاهواره هـا، تعیـین ردیـف بـازی آنهـا، طراحـی و ساخت آغازگرها و تهیه نقشه ژنتیکی آنها که مقدمه کاربرد این نشانگر است، بسیار پیچیده و مستلزم صرف وقـت و هزینـه بسـیار زیاد است، -2 در صورت توزیع نامناسب ریز ماهواره ها در طول ژنوم کاربرد موثر آنها در مکان یابی ژنها محدود می گردد، -3 تنوع بیش از حد ریز ماهواره ها کاربرد آنها را در تعیین قرابت افراد مورد سوال قرار داده است. به نظر می رسد استفاده از ریز ماهواره ها به همین دلیل فقط به شناسایی ارقام یا رده بندی گونه ای محدود خواهد شد و در تعیین قرابت بین گونـه هـای دورتـر کـاربردی نخواهد داشت و -4 کمبود تعداد ریزماهواره های شناخته شده در برخی از موجودات استفاده از آنها را در مکان یابی ژنهـا محـدود
کرده است
