بخشی از مقاله
چکیده:
تنوع ژنتیکی جمعیت ماهی ازون برون دو رودخانه کورا و سفید رود با استفاده از 15 جفت پرایمر میکروستلایت بر روي 92 نمونه مورد بررسی قرار گرفت. استخراج DNA به روش فنل و کلروفرم انجام شد و پس از ارزیابی کمیت و کیفیت آن، بوسیله 15 جفت پرایمر میکروستلایت PCR گردید. محصول تکثیر شده با استفاده از ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز و با نیترات نقره رنگ آمیزي شد. پس از رتبه دهی به اللها بر مبناي اندازه و طول هر باند برحسب جفت باز - bp - محاسبات ژنتیکی فراوانی اللی ، متوسط هتروزیگوسیتی مشاهده شده و قابل انتظار، تعادل هاردي وینبرگ، مقادیر Rst ، Fst بر اساس تست AMOVA میزان شباهت و فاصله ژنتیکی آنها با استفاده از نرم افزار Biocapt و GenAlex انجام گرفت.
ده جفت از پرایمرها ساختار پلی مورفیسم - چند شکلی - نشان داده ، یک جفت تک شکلی - مونومورف - و چهار جفت آن در شرایط PCR تکثیر نشدند. میانگین اللی و هتروزایگوسیتی رودخانه کورا 13 و 0/72 و سفید رود به ترتیب 12/41 و 0/65 بدست آمد. هر دو ناحیه در تمامی جایگاههاي مورد مطالعه انحراف از تعادل را نشان دادند. آنالیز آماري نشان می دهد که از نظر ژنتیکی اختلاف معنی داري بین نمونه هاي دو رودخانه وجود دارد - P<0/01 - و هر دو رودخانه داراي اللهاي اختصاصی بودند. نتایج حاصله بیانگر وجود جمعیت هاي مجزایی از ماهی ازون برون در جنوب دریاي خزر در محدوده آبهاي ایران و جمهوري آذربایجان است و پیشنهاد می گردد اقدام و برنامه ریزي لازم براي حفاظت و بازسازي ذخایر ژنتیکی آن صورت پذیرد.
مقدمه: ماهی ازون برون - Acipenser stellatus - از گونه هاي مهم تجاري تاس ماهیان دریاي خزر محسوب می شود که در سالهاي اخیر، ذخایر با ارزش آن رو به کاهش گذاشته است به طوریکه در فهرست ماهیان در معرض خطر اتحادیه IUCN قرار گرفته است - IUCN,1996 - حفاظت زیستگاه ها و محلهاي تخم ریزي طبیعی این ماهی از نظر حفظ تنوع ژنیتکی و بانک ژنی تاس ماهیان از اهمیت بالایی برخوردار است - پورکاظمی ،. - 1376 اگرچه به منظور بازسازي ذخایر این ماهی تکثیر مصنوعی آن هر ساله انجام می شود و سالانه هزاران بچه ماهی به دریاي خزر رها می گردد اما مشخص نیست که مولدین تکثیر شده مولدین بومی آبهاي ایران می باشند یا ماهیان سایر مناطق هستند که جهت تغذیه به جنوب دریاي خزر مهاجرت نمودهاند.
از آنجاییکه احتمال می رود در آینده تعیین سهمیه صید و صادرات خاویار براي هر یک از گونه ها بر مبناي شناسائی جمعیت ها و نژادها استوار گردد، از این رو شناسایی جمعیت ها ذخایر این گونه ضروري به نظر می رسد.در دریاي خزر دو اکوتیپ این گونه گزارش شده که از نظر مورفولوژي کاملا مشابه، ولی از لحاظ سن بلوغ ، میزان رشد ، هماوري و زمان تخمریزي با یکدیگر متفاوتند . - Holchic,1989 - نتایج بررسی هاي انجام شده توسط - 1996 - Pourkazemi و شعبانی - 1384 - در تعیین ساختار ژنتیکی ماهی ازون برون دریاي خزر با استفاده از mtDNA تنوع پایین ژنتیکی را نشان داد. به نظر برخی محققین mtDNA به قدر کافی قابلیت نشان دادن تغییر پذیري سطوح جمعیتی در بعضی گونه ها را ندارد - Fergusen . - and Duckworth, 1997
لذا استفاده از روشهاي مناسبتر براي نشان دادن تغییر پذیري بیشتر خصوصیات ژنتیکی با استفاده از مقایسه نمونه ها از مکانهاي متفاوت و اندازه گیري تمایز جمعیت ها با سایر روشها ضروري به نظر می رسد. میکروستلایت ها سطوح بالاي پلی مورفیسم را نسبت به لوکوسهاي هسته مانند آلوزیم ها دارند. به علاوه استخراج DNA براي آنالیز میکروستلایت ها به آسانی از بافتهاي مرده - مانند باله ها، مو - استخراج می شود که این امر در مورد کار با موجودات در حال تهدید یا در معرض انقراض ضروري به نظر می رسد - . - McQuown et al., 2003 همچنین میکروستلایت ها قادرند تمایز بسیار بالا و هم بارزي مار کرهاي DNA هسته اي با اختلاف جزء بندي شده از یک تا پنج جفت باز تکراري را نشان دهند. - Zajc et al., 1997 -
براي این منظور تحقیق حاضر با هدف تعیین ساختار جمعیتی و تنوع درون گونه اي و همچنین جداسازي جمعیتهاي احتمالی ماهی ازون برون رودخانه هاي کورا - جمهوریĤذربایجان - و سفید رود - ایران - صورت گرفت. مواد و روش ها: تعداد 92 نمونه ماهی بالغ صید شده شامل 49 نمونه از آذربایجان - رودخانه کورا - و 43 نمونه از رودخانه سفید رود جمع آوري و استخراج DNA به روش فنل و کلروفرم - Hill and Moritz, 1993 - تعدیل شده براي ماهیان خاویاري - Pourkazemi, 1996 - انجام شد. 15 جفت پرایمر میکروستلایت شامل LS-19 ، 34 ، 39 ، 54 ، 69 ، 57 ، 62 ، - May et al., 1997 - 68، Spl104 ، 105 ،113 ، 163 ، 168 ، 170 ، - McQuown et al., 2000 - 173 استفاده شد.
محصول PCR بر روي ژل پلی آکریل آمید برده و سپس بوسیله نیترات نقره رنگ آمیزي شد. پس از ثبت باندها، پارامترهاي فراوانی اللی، هتروزایگوسیتی مقادیر Rst و Fst ، شباهت و فاصله ژنتیکی و تعادل هاردي واینبرگ ، تنوع ژنتیکی بر اساس بر اساس تست AMOVA درسطح احتمال 0/01 در نرم افزار BioCapt و GeneAlex محاسبه گردید. نتایج: از 15 جایگاه مورد بررسی چهار پرایمر تکثیر نشده و یک جفت ساختار مونومورف نشان دادند. تمامی جایگاهها یک یا دو باند را نشان دادند. میانگین تعداد اللهاي مشاهده شده در هر جایگاه 13/3 و میزان آن از 13 تا 45 الل در هر جایگاه بود.
تعداد کل الل مشاهده شده در کورا 156 الل و در سفید رود 149 الل بود. در کل 257 الل مشاهده شد که 195 الل در فراوانی کمتر از 0/05 در همه نمونه ها بود. میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده و قابل انتظار رودخانه کورا به ترتیب 0/72 و0/86 و سفید رود 0/65 و0/84 بود. در بررسی تعادل هاردي – واینبرگ هر دو ناحیه مورد مطالعه براي هر جایگاه انحراف از تعادل را نشان دادند . - P<0/001 - میزان شباهت و فاصله ژنتیکی به ترتیب 0/580 و0/544 بدست آمد. بر اساس تست AMOVA میزان Fst و جریان ژنی به ترتیب 0/058 و 3/227 و میزان - P<0/001 - Rst= 0/167 محاسبه شد.
بحث: علت عدم تکثیر چهار جفت از پرایمر می تواند به خاطر عدم وجود جایگاه پرایمرهاي فوق در DNA ماهی ازون برون باشد و این امر به دلیل استفاده از پرایمرهاي غیر اختصاصی بوده که پرایمرها از گونه هاي تاس ماهی دریاچه اي و پاروپوزه ماهیان طراحی شده بودند. هتروزایگوسیتی موجود در هر ناحیه نمونه برداري نشان دهنده وجود تنوع ژنیتکی در گونه مورد بررسی است. آنالیز آماري - - AMOVA نشان داد که جمعیت هاي موجود در هر منطقه از نظر هتروزایگوسیتی با هم اختلاف معنی داري دارند . - P<0/01 - اما در مطالعات قبلی Pourkazemi, 1996 - ؛ شعبانی، - 1384 اختلاف معنی داري بین نمونه هاي مناطق مختلف جنوب دریاي خزر بدست نیامد. این اختلاف ممکن است ناشی از نوع ژن و روش تحقیق بکار برده باشد.
چنانکه در مطالعات دیگر از جملهMcQuown و همکاران - - 2003 پیشنهاد می کنند که mtDNA کارایی لازم را براي نشان دادن قابلیت تغییر پذیري و سطوح متمایز جمعیتی نداشته و استفاده از روشهاي بهتر همانند میکروستلایت ها ضروري است. میانگین اللی و میزان هتروزایگوسیتی محاسبه شده در این مطالعه بالاتر از مقدار محاسبه شده براي ماهیان آنادروموس 11/3 - و - 0/68 است - Dewoody & Advise, 2000 - و این امر نشان دهنده تنوع بالاي ژنتیکی ماهی ازون برون در این دو منطقه است. ماهی ازون برون در هر دو رودخانه داراي اللهاي اختصاصی بود. اما وجود تعداد زیاد الل با فرکانس پایین بیانگر گذر از تنگناهاي ژنتیکی مانند افزایش فشار صید، از دست دادن زیستگاههاي تخمریزي طبیعی است .
Alarcon et al., 2004 - تنوع اللی با حساسیت بیشتري نسبت به هتروزایگوسیتی می تواند اختلاف ژنتیکی را اندازه گیري کند زیرا تنگناهاي ژنتیکی همانند وقایعی که موجب کاهش تعداد الل می شود - به ویژه نمونه هاي کمیاب - بدون داشتن اثر قابل مشاهده روي هتروزایگوسیتی دیده می شود . - Norris et al., 1999 - کاهش اللی سریعتر از کاهش هتروزایگوسیتی روي می دهد زیرا کاهش در فراوانی اللهاي شرکت کننده سریعتر از کاهش هتروزایگوسیتی کل است - . - Maruyama and Fuerst, 1985 در این بررسی در تمامی مناطق نمونه برداري شده و در تمامی لوکوس ها هتروزایگوسیتی مشاهده شده نسبت به هتروزایگوسیتی قابل انتظار پایین تر بود ، که این امر نشان دهنده کاهش تنوع ژنتیکی نمونه ها است.
علت آن می تواند به خاطر تنگناهاي ژنتیکی بر اثر صید بی رویه، از دست رفتن زیستگاه هاي تکثیر طبیعی و آمیزش هاي خویشاوندي بوسیله تکثیر مصنوعی در مراکز تکثیر و بازسازي ذخایر باشد که با گذشت زمان موجب کاهش الل و کاهش هتروزایگوسیتی در ذخایر می شود . - Alam,2003 - انحراف از تعادل هاردي-واینبرگ در تمام جایگاهها احتمالا به خاطر مهاجرت ماهی در مناطق نمونه برداري ، وجود اللهاي صفر ، طول عمر بالاي گونه و همچنین جمع آوري نمونه ها از دریا می باشد.
تمایز ژنتیکی ماهی ازون برون در دو رودخانه نشان دهنده وجود کلونی هاي متفاوتی از جمعیت این ماهی است. این بررسی وجود جمعیتهاي متمایز این گونه را نشان می دهد و براي حفاظت از ذخایر ژنتیکی آن ضروري است توجه و اقدام جدي صورت پذیرد. طبق واقعیت هاي موجود ، تعداد مولدین ازون برون مهاجر جهت تخم ریزي به رودخانه هاي ایران در هر سال کاهش می یابد و از طرف دیگر میزان تکثیر مصنوعی و رهاسازي بچه ماهیان این گونه بسیار اندك می باشد.
با توجه به مستقل بودن ذخایر ژنتیکی و جمعیت ماهیان ازون برون در رودخانه سفید رود استان گیلان است ضروري است برنامه ریزي هاي جامع براي کنترل صید در منطقه فوق و اقدام جدي تر براي احیاء ذخایر این گونه صورت پذیرد. تشکر و قدردانی :این تحقیق با حمایت مالی موسسه تحقیقات شیلات ایران در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی انستیتو تحقیقات بین المللی ماهیان خاویاري دکتر دادمان رشت انجام شد. صمیمانه از کارشناسان ارجمند بخش ژنتیک انستیتو تشکر و قدردانی می شود.
